电纺plga纤维支架的制备及细胞相容性研究

电纺plga纤维支架的制备及细胞相容性研究

硫酸-甲基乙酸酸酯（plga）是一种广泛使用的生物可分解高材料。它具有良好的生物适应性和易于加工的性能。近年来,随着组织工程学的兴起和迅速发展,PLGA成为组织工程支架的首选材料之一。在组织工程中,除了考虑材料的化学性质、表面性能外,还应考虑多孔三维细胞支架的结构,如孔隙形态、大小、连通性、孔隙率等,以利于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送及代谢产物的交换,而支架的结构取决于三维支架制备方法。PLGA多孔支架可以采用多种方法制备,包括纤维粘接、溶液浇铸/粒子沥滤、气体发泡、相分离技术、快速成型技术等。静电纺丝是一种简便易行的新型组织工程多孔支架制备方法,具有其他方法不具备的独特优势。静电纺丝可制得直径在纳米到微米尺度的纤维,用它制备的组织工程支架,具有多孔的结构,比表面积大,适合于细胞的迁移和增殖。因此,近年来采用静电纺丝制备PLGA多孔支架成为研究的热点。为了获得稳定的、结构均匀的静电纺丝PLGA纤维支架,本研究以溶液浓度、电场强度和纺丝间距等三个主要影响参数为考察对象,采用组合的方法,研究了制备参数对支架形貌结构的影响规律。并考察了成纤维细胞在支架上的粘附、增殖及形态,对细胞在此纤维结构上的相容性做了初步研究。1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器PLGA(M=40000,PLA/PGA=50∶50,山东省医疗器械研究所);四氢呋喃(AR,国药集团试剂有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(AR,国药集团试剂有限公司)。1.2plaga纤维的制备以配比为3∶1的四氢呋喃与N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,配制浓度为0.15g/ml、0.2g/ml、0.25g/ml、0.3g/ml的PLGA溶液,喷丝头与接收转桶的间距为6cm,在0.75～1.5kv/cm范围内调节电场强度,在0.4～1.2ml/h范围内调节流速进行静电纺丝,收集、干燥后获得具有不同表面形貌的PLGA纤维支架。电纺装置如图1所示。1.3sem及sem分析分别取支架样品,将其表面经离子溅射仪喷金镀膜后,用JXA-8100(JEOL,Japan)扫描电镜(scanningelectronmicroscopy,SEM)观察支架的表面形貌。采用图像分析软件测定扫描电镜照片中支架的纤维直径,每个样品的电镜照片至少取10根纤维计算平均直径。1.4细胞前基质材料将材料裁成1cm×1cm大小,紫外灯照射20min,然后用无菌磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)冲洗3次,加入细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM)浸润过夜,接种细胞前将材料移至24孔板。原代培养的人真皮成纤维细胞体外传代培养至5～10代,待细胞铺满培养皿底部时,用0.25%胰酶消化成2×106/ml细胞悬液,按2×104/cm2的密度接种于灭菌处理好的材料表面,待细胞黏附2h后,加入足量的DMEM+10%FBS细胞培养液培养,隔天换液。1.5细胞黏附实验细胞接种材料24h后,每孔加入100μl5mg/ml噻唑蓝[3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]溶液,37℃恒温培养箱反应4h,将复合物移至新的24孔板,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶出材料上的细胞内的结晶紫,在DIAreader(Elx800G,DIALABGMBH,Vienna,Austria)上,以490nm波长测溶出物吸光值。用已知浓度(0.25×104,0.5×104,1×104,2×104,4×104/ml)培养24h的单层细胞测吸光值,得到细胞数-吸光值标准曲线。依据标准曲线求出细胞在材料上的黏附率。该实验重复3次,每次实验设4个平行对照孔。在细胞接种材料后的1d、4d、7d、10d、14d分别取材,做MTT增殖实验,方法同上。该实验每个时间点设4个平行对照孔。结果表示为平均值±标准差,显著性差异通过学生氏t检验进行判断,以P<0.05为有统计学意义。待细胞在材料表面培养至7d,取出细胞-材料复合物,用PBS洗去残余培养液,放入2.5%戊二醛溶液固定,临界点干燥,离子溅射仪喷金镀膜后,用JXA-8100(JEOL,Japan)扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附和伸展情况。2结果2.1纺丝溶液浓度对纤维直径的影响由图2可以看出,当纺丝溶液浓度为0.15g/ml时,得到的静电纺纤维支架中有很多纺锤形的珠滴。随着纺丝溶液浓度的增加,纤维膜中珠滴逐渐减少,当纺丝溶液浓度为0.25g/ml时,珠滴基本消失。由图3发现,随着纺丝溶液浓度的增大,纤维直径逐渐增大,并且纤维直径的分布范围也增大了。当浓度为0.15g/ml时纤维直径主要集中在100～200nm之间,分布较为集中。当浓度增加为0.3g/ml时,纤维直径相对均匀地分布在400nm到1100nm之间。2.2纤维原料的流变性由图4可以看出,当流速为0.4ml/h时,纤维支架中仍出现少量的珠滴。流速增大,支架表面则以单一的纤维为主。纤维的平均直径随溶液流量的增加略有增大,从0.4ml/h时的330nm增大至1.2ml/h时的560nm。2.3纤维表面结构的研究由图5可以看出,当电场强度低于1.25kv/cm时,纤维支架的表面结构以纺锤形的珠滴和纤维共存。当电场强度为1.5kv/cm时,支架中纺锤形的珠滴完全消失,获得单一纤维的表面形貌。电场强度变化对纤维直径的影响不大,直径分布在325nm～375nm之间。2.4流速和电场强度由图6可以看出,在我们研究的几个参数中,浓度对静电纺丝纤维的直径影响最大,流速次之,而电场强度对纤维直径的影响很小。这与Mo等研究P(LLA—CL)所得到的结果一致。同时发现,流速的变化及电场强度的变化中,各自纤维直径的分布并没有特别明显的区别,因此不再对这两种参数变化所得纤维的直径分布进行分析比较。2.5细胞肺癌实验2.5.1plaga纤维的细胞表面形貌根据以上的实验结果,在浓度为0.2g/ml、流速为0.4ml/h、电场强度为1.5kv/cm这样的条件下制备的静电纺纤维直径分布最窄、珠滴最少、纤维直径最小,纤维的平均直径为330nm。因此,在以下的细胞相容性实验中,以这个条件下的PLGA纤维支架为样品来测试细胞的相容性。经过3次重复实验,细胞在材料上接种24h后的黏附率为76%。2.5.2细胞生长曲线通过MTT试验观察细胞在材料表面体外培养14d内的生长和增殖情况,细胞生长曲线见图7。结果显示,在培养的10d内,细胞数量几乎呈线性增长;第10～14d,细胞数量显著增加,细胞增殖明显。但在培养的14d内没有出现平台期。2.5.3细胞激活和细胞外基质将成纤维细胞接种在PLGA纤维支架上,培养7d后,发现细胞已基本铺满支架表面,达到了融合状态。细胞伸展良好,有大量的细胞外基质分泌。扫描电镜结果显示于图8。3浓度和电场强度对plga纤维支架形态的影响静电纺丝是一种简单、有效又便宜的获得超细纤维支架的制备方法。静电纺丝过程中,高聚物溶液在静电力推动下从针头喷出。当加载了高电压,静电荷在高聚物表面诱导成液滴。当电场强度增大到一定值时,电荷间相互排斥,外部电场产生的库仑力与液滴表面张力相抵消,产生高聚物射流。通过一个不稳定的拉伸过程射流变得细长。静电纺丝过程中溶剂逐渐蒸发,充满电荷的高分子纤维堆积在接地的收集装置上。通过静电纺丝制备的纤维膜具有很大的比表面积和很小的孔径,而且获得的这种结构类似天然细胞外基质中的胶原纤维网络。在天然的组织内,胶原纤维的直径在30～300nm的范围内,而静电纺丝纤维直径在300～1000nm,同样可以为细胞粘附、增殖及迁移提供一个适当的环境,其效果与天然细胞外基质相近。目前,已有多种静电纺制备的生物可降解纳米纤维作为临时支架用于组织重建。PLGA静电纺纳米纤维支架在制备过程中,其形貌和结构会随着纺丝参数的变化而变化。本研究制备的PLGA纤维支架的形貌随试验参数的变化出现纤维或珠滴。当溶液浓度低于一定值时,会出现较多的液滴或珠状物。这是由于纺丝溶液表面张力与粘度竞争作用的结果。表面张力试图降低单位质量(体积)的表面积,从而导致聚合物球或珠状物的出现。粘弹力阻止珠状物的形成,有利于促使光滑纤维的形成。因此,当用浓度较低的溶液进行纺丝时,表面张力的作用大于粘弹力的作用,从而出现较多纺锤形的珠滴/液滴或珠状物。当浓度增加,支架形貌逐渐过渡为纯纤维结构。浓度的变化对纤维直径也有较大的影响。这是由于浓度增加,纺丝溶液粘度随之增加,在静电纺丝过程中,喷射的纺丝溶液在电场中需要克服更大的表面张力,喷射流体分裂能力减弱,导致纤维直径提高,分布不均匀。但质量分数过大,使溶液黏度过高,溶液流动性降低,会加剧喷头堵塞。流速对纤维支架的形貌和直径的影响则是因为当纺丝溶液浓度和实验所用的电场强度固定时,流速过大使单位时间内喷射出的溶液过多,纤维没有被及时牵伸,导致直径变大。同时由于溶剂无法充分挥发,纤维在到达接收屏之前没有完全凝固而成为珠状物或液滴,或是形成条带状的物质。通过对不同电场强度下得到的静电纺丝纤维支架的SEM照片进行观察,我们发现当电场强度较小时,纤维中纺锤形的珠滴比较多,而随着电场强度的增大珠滴逐渐减少。这是因为随着电压增大,纺丝溶液的表面电荷密度增加,静电斥力提高;电场强度的提高使射流获得更大的加速度。在这两个因素的作用下,射流及其形成的纤维承受的拉伸应力提高,从而获得更高的拉伸应变速率,拉伸更充分,所以珠滴减少。然而电压增大会使一些纤维挂在孔壁,逐渐阻塞喷丝口,使纺丝无法顺利进行。PLGA是目前广泛应用于骨、软骨、血管、神经、皮肤等组织的生物可降解材料,显示出良好的临床应用前景。PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点并能方便地控制其分子量、降解时间、孔隙率和孔径等性能,但细胞在支架上的生长、移植和内生长率则直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。本研究制备的静电纺PLGA纤维支架,以成纤维细胞来初步考察支架结构对细胞生长的适应性。结果显示,纤维支架能够使成纤维细胞很好地粘附,并得到较好增殖,而且细胞在支架上呈单层铺展,这表明,通过静电纺丝制备的PLGA纤维支架具有良好的细胞相容性,此纤维多孔结构是成纤维细胞的良好载体,将有可能应用于皮肤组织工程及其他组织构建。采用静电纺丝技术制备的PLGA纳米纤维支架具有很大的比表面积,因此被广泛应用于组织再生、药物释放等方面。目前,静电纺丝技术的广泛应用和逐步成熟使得我们能够获得理想的形貌和结构,但在组织工程领域,单纯无纺的PLGA纤维支架仍存在强度低,相容性不能完全满足要求等问题。将PLGA和其他材料进行复合,采用静电纺丝技术制备复合支架是解决办法之一。Pan等将葡萄糖和PLGA复合制备出多孔静电纺支架,结果显示支架能够很好地维持成纤维细胞的活性和功能,使得成纤维细胞呈类似于真皮结构的致密多层排列。静电纺丝技术结合编织等其他方法,则可以显著提高纤维支架的力学性能,从而满足肌腱等组织工程的要求。本文仅从静电纺丝制备参数对纤维支架的形貌和结构影响出发,初步考察了PLGA纤维支架的细胞相容性,在后续的工作中还将从纤维结构对细胞的影响,复合无机或天然聚合物来提高或改善PLGA的性能,制备有序排列纤维的支架等方面做进一步的工作,使得静电纺PLGA纤维支架更好地应用于组织工程。4plaga纤维的直径通过静电纺丝技术可以获得具有纤维-珠滴结构的PLGA