发酵中d头孢霉AL031真菌次生代谢产物中甘露醇的提取

发酵中d头孢霉AL031真菌次生代谢产物中甘露醇的提取

d-甘露醇是药物中常用的佐剂。临床上常用的渗透利尿剂主要用于脑水肿和青少年。这是减少颅内压的安全有效药物。用于工业设施、电泳溶液和合成树脂。在上世纪末,由于D-甘露醇的一些特殊生理功能,如使用后不引起血糖水平波动,不引起牙齿龋变以及低热值等特性,甘露醇作为调味剂和食品添加剂的用量在世界范围内迅速增加。头孢霉AL031(Cephalosporiumsp.AL031)菌株是本课题组从云南省哀牢山箭竹上分离筛选到的一株丝状真菌。通过抗菌活性试验证明,其次生代谢产物具有良好的抗细菌、真菌活性,可望开发为药用真菌。该真菌为我们首次获得,通过数年的引种驯化培育,现已可通过液体发酵而在实验室中批量制备此真菌。并且,从该真菌液体发酵菌丝体的氯仿提取物中已分离得到3,4-二氢异香豆素、甾醇等化合物。为了充分开发利用此真菌资源,我们开展了综合利用研究。本文报道,头孢霉AL031真菌液体发酵菌丝体干品和固体发酵物中,D-甘露醇不经过柱层析的直接提取,鉴定及获得率。1实验部分1.1红外光谱和核磁共振测定PHMK79/2523显微熔点仪,PE-1640型付里叶变换红外光谱仪,FT-80A核磁共振仪,ElementarVarioEL元素分析仪。1.2材料的制备与真菌的发酵1.2.1病毒筛选自滇中哀牢山,经云南大学生物系杨发蓉教授鉴定为丛梗孢科,头孢霉属真菌(CephalospriumCorda)。1.2.2发酵物的制备按文献的方法进行头孢霉AL031真菌的液体发酵。发酵物经过滤分为菌丝体和发酵液两部分,菌丝体用蒸馏水洗涤后,在60℃烘箱中烘干备用;发酵液用作分离该真菌抗菌活性成分的原料。1.2.3面28%,蛋白2%培养基:马铃薯(煮熟)40%,麦麸30%,玉米面28%,蛋白胨2%。培养方法:上述培养基经灭菌后,接入10%的菌种,24-26℃固体发酵培养10天,得褐色刺球状菌体,在60℃烘箱中烘干备用。1.3双晶法提取法取液体发酵菌丝体干品20g,用乙醇加热回流提取五次,收集提取液浓缩,静置后,析出结晶,抽滤,即得粗品。用蒸馏水溶解,经活性炭脱色后,用蒸馏水和95%乙醇(1∶2)重结晶,得白色针状晶体A1.02g。取干的固体发酵菌丝体20g,按上法提取分离得白色针状晶体B0.18g。1.4hnmr-1,3.晶体A:m.p.166-167℃;[α]D20+23°;元素分析:C39.53%,H7.92%(理论值C39.55%,H7.75%);IRcm-1:3386.7,3285.3,2939.1,1458.5,1373.0,1085.0,1020.7,953.8,727.7,631.9;1HNMR(80MHz,D2O,δppm):3.5-4.0(14H,m)。晶体A与D-甘露醇标准品按以下比例混合后,测其熔点,混合m.p.166.5-167.5℃(1∶1);混合m.p.166-167℃(1∶9);混合m.p.165.5-166.5℃(9∶1)。晶体B:m.p.165-166℃;[α]D20+23°;元素分析:C39.51%,H7.89%(理论值C39.55%,H7.75%);IRcm-1:3383.4,3286.6,2938.2,1457.0,1372.8,1083.0,1021.9,955.7,728.7,633.1;1HNMR(80MHz,D2O,δppm):3.5-4.0(14H,m)。晶体B与D-甘露醇标准品按以下比例混合后,测其熔点,混合m.p.166-167℃(1∶1);混合m.p.165.5-166.5℃(1∶9);混合m.p.166.5-167.5℃(9∶1)。2结果与讨论2.1红外和核磁共振光谱晶体A和晶体B的理化常数和波谱数据表明,它们为同一种化合物。它们的红外光谱图中,3400-3200cm-1处强而宽的吸收峰,为缔合-OH峰;在1087cm-1和1025cm-1处的两个强吸收峰,为C—O键的伸缩振动峰;而且它们的红外光谱、核磁共振氢谱与D-甘露醇标准图谱一致,熔点、比旋光度也与文献值相符,又与D-甘露醇标准品混合熔点不下降,说明晶体A和晶体B为D-甘露醇。为与D-甘露醇标准品进行比较,我们还测定了D-甘露醇标准品的红外光谱,与晶体A的红外光谱对照后,我们发现两图谱在1460-1100cm-1附近吸收峰的位置和峰形均有一定差异,这可能是由于它们的来源不同,从而导致其红外光谱不同。2.2菌固体发酵物中d-甘露醇的获得率头孢霉AL031真菌液体发酵菌丝体中,D-甘露醇的获得率为5.1%,明显高于头孢霉AL031真菌固体发酵物中,D-甘露醇的获得率(0.9%);甚至高于天然产的竹红菌、竹黑菌和竹黄中,D-甘露醇的获得率(4%、0.6%和0.6%)。液体发酵发酵周期短(只需4-5天),易于工业化,在头孢霉AL031真菌通过液体发酵产生抗菌活性物质的同时,D-甘露醇作为一个副产品获得,是经济可行的。3原生代谢产物头孢霉AL031真菌,通过液体发酵不仅