下丘脑室旁核神经元内fos蛋白的光镜观察

下丘脑室旁核神经元内fos蛋白的光镜观察

气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道炎，其发病机制非常复杂。目前研究多集中于局部因素对气道炎症的影响机制,近五年来研究发现中枢神经系统在哮喘发作中发挥着重要作用,即脑内核团感受到外周气道经迷走神经传入的炎性信息,继而调控哮喘的发生、发展。目前对哮喘的神经反射性调控的研究主要集中在传入神经通路方面,而对传出调控途径的研究不多。下丘脑室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)是下丘脑前区最显著的核团之一,是调节多种内脏活动的高级中枢,对哮喘发作有着调节作用,但其神经调控机制尚不清楚,国内外亦未见文献报道。因此,本文以WGA-HRP逆行追踪法与免疫组织化学染色法(ABC法)相结合的双重标记方法,研究下丘脑室旁核调控哮喘大鼠发作的神经途径。材料和方法1.大鼠的分组与模型健康雄性成年SD大鼠64只,体重250~350g,由东南大学医学院实验动物中心提供,在安静、温暖(18~25℃)、避强光、昼夜光照节律(明暗周期为10/14h)的实验室预饲养1周,自由饮水和摄食。大鼠随机分成两大组,(1)对照组:分为①正常组(n=8),大鼠在上述环境下饲养48h,不行任何手术;②假手术组(n=8),大鼠在致敏、吸入激发和静脉激发阶段及手术只进行操作,不涉及任何药物;③生理盐水(NS)组(n=8),大鼠在致敏、吸入激发和静脉激发阶段均以NS代替卵蛋白(OVA)混悬液。(2)哮喘模型组:①Fos组,行Fos免疫组化反应,包括哮喘激发后30、60、90、120min共4个组,每组8只;②HRP+Fos组(n=8):WGA-HRP逆行标记结合Fos免疫组化双重标记法。2.超声雾化+连续雾化根据Elwood等的方法,哮喘模型组大鼠腹腔注射用卵蛋白100mg、氢氧化铝100mg、灭活的百日咳杆菌5×109个配成的混悬液1ml/次,两周后用超声雾化器给大鼠雾化吸入1%OVA生理盐水溶液(2~3ml·min-1,颗粒直径≤5μm),每天1次,每次20min,连续雾化3d后,大鼠呼吸频率明显加快,并出现一系列行为变化(烦躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困难、喘息、肋间肌和腹肌明显收缩、咳嗽等)。3.方法3.1有机溶剂的制备对照组及Fos组动物,经0.4%戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射。用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)经心脏常规灌流固定、取材。切取延髓及间脑段,置于上述固定液中后固定4h,浸入含30%蔗糖的PB溶液中4℃,48h至沉底。恒冷箱冰冻连续冠状切片(片厚40μm)。3.2羊抗兔的血清实验切片浸入新鲜配制的0.3%甲醇双氧水溶液中,浸泡30min,以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水漂洗3次,2~3min/次,随后置入正常山羊血清封闭液,室温20min,勿洗。然后依次加入兔抗Fos血清(1∶300,SantaCruz产品)孵育,室温30min后4℃孵育12h,随后进入生物素标记的羊抗兔IgG及SAHRP,每步骤间用PBS洗涤。继之用DAB法室温呈色,显微镜下控制反应时间,终止显色后贴片,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片后镜下观察。阴性对照用PBS代替兔抗Fos一抗,其他染色步骤同上。3.3单笼饲养组siga-hrpHRP+Fos组动物经0.4%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立体定位仪,切开环枕后膜,暴露延髓背面,直视下于闩水平,正中线旁开0.3~0.5mm,深度为0.8~1.0mm,用前端接有微玻管(直径为40~60μm)的1μl微量进样器将4%WGA-HRP(Sigma)0.1μl缓慢注入一侧DVC,NS组注入NS0.1μl,假手术组只施予上述手术,不注入任何液体,缝合后单笼饲养,其余步骤同前所述。3.4dvc注射区的扩增切片按Mesulam的四甲基联苯胺(TMB)法进行WGA-HRP呈色反应,含注射区的延髓切片进行中性红复染,以显示细胞形态确定注射区是否局限于DVC。光镜下选取DVC注射区准确的同套大鼠间脑切片,随后用DAB和氯化钴法加强TMB反应产物;充分洗脱后用ABC法进行抗Fos的免疫组化反应(DAB-H2O2棕色法呈色),步骤同上述Fos免疫组织化学染色。3.5动物细胞计数Fos免疫组化切片中随机取每只大鼠包含PVN、DVC对应的典型平面切片5张,选取含有HRP逆行标记神经元及同时含有HRP逆行标记神经元和Fos阳性反应物质的间脑连续冠状切片,将待测切片置于与计算机连接的显微镜下(×100),每张切片选取4个不同视野,用加拿大JD801图像分析系统观察计数,取该例动物各平面的平均数,即为该动物该核团的阳性细胞计数,每组8个动物间取平均值,即为该组动物该核团的阳性细胞计数。实验结果以x¯±sx¯±s表示,采用t检验,P<0.05表示差异有显著性意义。wga-hrp逆标神经元/细胞间亚核fig/b光镜下观察,正常组、假手术组和NS组中大鼠丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、DVC等内均可见散在的Fos免疫反应阳性物质分布,多为浅染,数量很少,且无密集分布区,组间无明显差别。哮喘发作后,下丘脑室旁核Fos免疫反应阳性物质呈双侧分布,其含量从哮喘激发后30、60、90min逐渐升高(Fig.1E-G),120min达高峰(Fig.1H),与正常组、假手术组和NS组的Fos表达的数量在统计学上均具有显著性差异(P﹤0.01,表1,Fig.1A-H)。DVC内Fos免疫反应阳性细胞数见表1,哮喘各组与对照组相比,均有显著性差异(P<0.05)。所有Fos阴性对照切片上均呈阴性反应。WGA-HRP注射区局限于一侧的迷走神经复合体(Fig.2A),即光镜下可见WGA-HRP蓝色反应物集中于左侧迷走神经复合体。迷走神经复合体主要由位于第四脑室底的迷走神经背核和孤束核构成,迷走神经背核内神经元中等大小,呈梭形或三角形;孤束核在延髓冠状切片上毗邻于迷走神经背核的上方,其内细胞较小,主要呈卵圆形或圆形。哮喘组动物脑切片上有三种类型阳性神经元(Fig.2B,C),即Fos、HRP单标神经元,HRP/Fos双标神经元。Fos阳性神经元的胞核呈棕黄色,细胞质未染,胞体和突起未显示。HRP逆标神经元细胞质内有许多细的黑色颗粒,有的可显示胞体和轮廓,细胞核不着色(Fig.2C)。HRP/Fos双标神经元为黄色胞核的周围有许多小的黑色颗粒(Fig.2C中箭所示)。由于Fos和HRP标记的部位、形态和颜色不同,上述各类细胞在镜下易区别。大鼠下丘脑室旁核分为多个亚核,在本研究中我们采用Swanson和Kuypers的划分命名法,其中包括3个大细胞部(前、内、后部)及5个小细胞部(前、内、背、外和室周部)。HRP逆标神经元密集分布于下丘脑室旁核小细胞部的内侧亚核和外侧亚核,散在分布于背侧亚核,前小细胞亚核未见逆标细胞(Fig.2B),以注射区同侧为主。前囱后1.65mm层面与1.80mm层面之间的PVN内HRP逆标细胞数为84.38±17.75;AP-1.85层面与AP-2.30层面之间的PVN内HRP逆标细胞数为45.13±15.46。PVN内HRP逆标细胞总数为64.75±25.87。HRP/Fos双标神经元主要见于PVN的内侧亚核(AP-1.65~AP-1.80)及PVN的外侧大细胞亚核(AP-1.85~AP-2.30)。HRP/Fos双标细胞数为28.63±6.78,占WGA-HRP逆标神经元总数的44.22%,占哮喘120min组Fos免疫阳性细胞数的7.79%(表2)。gh3受体激动剂治疗有感冒Fos蛋白是中枢神经系统内神经元被激活的重要的标志物,中枢神经系统通过c-fos基因的表达将外界刺激信号转变为细胞内基因表达的刺激信号,从而对外界的刺激作出应答。它既具有灵敏、分辨率高的特点,又具有把形态和功能联系起来的特征。由于Fos蛋白可被多种刺激诱导表达,所以实验中我们尽量减少非特异性刺激,并增设了假手术组及生理盐水组,以保证实验中Fos蛋白表达的可靠性。结果显示,正常组、假手术组和生理盐水组中PVN、DVC内Fos蛋白免疫阳性细胞数组间无显著差异,排除了手术和示踪剂对Fos蛋白表达的影响。本实验结果观察到与对照组相比,哮喘大鼠发作时,PVN、DMV和NTS等多个脑区Fos蛋白表达明显增多,表明这些核团与哮喘发作有着密切的联系。PVN是调节内脏活动的高级整合中枢,具有广泛的生理作用,对心血管、水盐代谢、摄食和能量利用、内分泌、应激反应和防御反应都有影响,它能把不同生理状态下的内脏活动和其它生理活动联系起来。我们以往的研究工作也观察到,下丘脑室旁核对呼吸和哮喘发作有着调节作用,PVN内微量注射P物质(SP)可加快豚鼠呼吸频率,膈肌放电频率及放电峰值均增加,表明PVN内微量注射SP对呼吸中枢具有兴奋作用,此作用可被SP的拮抗剂特异性地阻断。PVN内微量注射组胺H3受体激动剂,调节PVN内神经元活动,可减轻气道粘膜炎症及气道高反应性,改善哮喘大鼠的肺功能;且我们后继研究工作亦发现,哮喘大鼠急性发作过程中,PVN脑电活动增强,进一步提示PVN与哮喘发作关系密切;对PVN内神经元细胞外放电的研究发现,哮喘大鼠发作时,其放电活动增强,而电损毁PVN可改善哮喘症状,提示PVN对哮喘发作起着重要的调控作用。其具体调控机制如何,目前国内外尚未见报道。深入探讨高位中枢对哮喘的调控机制有利于为哮喘的防治提供新的研究方向。众多研究表明,NTS是哮喘炎性信息传入的低位整合中枢。胡春梅等研究亦发现,哮喘大鼠向NTS内微量注射1μgH3受体激动剂R-α-methylhistamine(RMHA)后,PVN、NTS等核团Fos蛋白表达减少;而用H3受体拮抗剂thioperamide(Thio)5μg预处理则可拮抗RMHA的上述效应。有文献报道,DMV内神经元可调节气道的分泌过程。而气道分泌亢进是哮喘发病原因之一,提示DMV可能与哮喘有着密切的功能联系。NTS和DMV均位于延髓背侧,在解剖结构上联系紧密,被合称为延髓迷走神经复合体(DVC),DVC是调节呼吸的基本中枢。由此可见,哮喘大鼠发作时,高位中枢PVN及低位中枢DVC内神经元兴奋性均升高。PVN与DVC之间是否存在结构或功能联系?为进一步明确它们之间的联系,本实验中将WGA-HRP注入一侧DVC,然后逆行标记PVN内神经元后,观察到HRP逆标神经元主要分布于同侧PVN内侧亚核、外侧亚核和背侧亚核,证实PVN内神经元发出纤维投射到DVC。这与Portillo等研究PVN与DVC之间的联系所观察到的结果基本一致。将示踪技术、免疫组织化学技术结合起来建立的双重标记方法,可同时显示神经元的功能活动状态、传导通路。本实验采用此双重标记方法,观察到将逆行追踪剂注入DVC后PVN内HRP逆行标记的神经元与Fos双重标记神经元主要分布于PVN内侧小细胞部神经元,且双标神经元的数量占HRP逆标神经元数的44.22%,表明PVN-DVC这条通路在哮喘中起重要作用。而在哮喘激发120min后,大量Fos阳性神经元出现在DVC。这一结果提示哮喘发作时,PVN通过其内的投射神经元将兴奋冲动传递至DVC,从而激活DVC的神经元表达Fos,表明PVN-DVC通路在哮喘发作中发挥着重要的调控作用。哮喘的神经源性炎症研究认为,来自于气道上皮、粘膜、平滑肌等处的刺激均可由迷走神经传入纤维经结状神经节,传递至延髓的NTS,使其兴奋性升高,继而使存在于迷走神经感觉传入纤维中的神经肽释放,导致粘膜腺体分泌亢进、支气管平滑肌痉挛、血管通透性增加、气道粘膜水肿等,致使炎症进一步加剧,从而加重哮喘症状。因而我们推断:哮喘发作时,外周炎性信息经迷走神经传入NTS,整合后信息又传入高位中枢PVN,导致PV