心理应激诱发实验性2型糖尿病倾向大鼠心身5号的调节作用

心理应激诱发实验性2型糖尿病倾向大鼠心身5号的调节作用

1材料和方法1.1动物饲养及管理120只健康雄性wistar大鼠，体重120.150g。由军事医学科学院第四研究所提供。适应性饲养1周。动物室内自然光照。室温保持24℃,通风良好。饲以全价营养料,自由进食饮水,除实验应激外无其他不良刺激。1.2动物模型与组成1.2.1实验大鼠的柠檬酸缓冲液和时间120只大鼠随机分为两组,一组为40只,另一组为80只。80只大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司产品,溶解在0.1mol/L柠檬酸缓冲液内,pH为4.0),30mg/kg,1次/d,连续2d(参考《现代药理实验方法与技术》)。余40只大鼠注射等量柠檬酸缓冲液,1次/d,连续2d。注射30日后测查大鼠空腹血糖,以9.3mmol/L为标准(参考《现代药理实验方法与技术》),筛除高血糖鼠,再随机选取45只STZ鼠和20只正常鼠进入应激造模实验。1.2.2各组stz+应激的比较全部动物共分为5组,其中45只STZ大鼠随机分为3组,即单纯STZ组(无应激)、STZ+应激组、中药组(STZ+应激),15只/组。20只正常大鼠分为应激组和正常组,10只/组。1.2.3旋转、撬气充量1)限制:将大鼠放入20cm×5cm×5cm塑料筒中,水平置于实验台,保证大鼠不受压。以不能回转身为度,但其运动受限制,光线晦暗,限制刺激每周随机择时进行3次,每次45min。2)旋转:利用旧式唱机改装为旋转器,转速为45r/min,在此转速下离心力最小,避免离心力过大伤害大鼠。旋转时将大鼠置于代谢笼中。旋转刺激每45~150min内择时进行1次,每次15~20min。旋转刺激隔日进行1次。3)拥挤:标准大鼠饲养笼,按应激组15只/笼,非应激组5只/笼喂养。刺激贯穿于实验全过程,持续6周。2-1蒸煮和贮藏心身5号由旋覆花、代赭石、陈皮、茯苓、半夏、竹茹、丹参、赤芍、降香、乌药、栝楼、远志、炙枇杷叶、合欢皮、知母、苍术、龙齿、黄芩组成,自动煎煮机煎煮,浓缩后置于-20℃冰箱贮藏备用。中药组大鼠灌胃2mL/次(其生药浓度为960g/L),2次/d至实验结束,余组大鼠给予等量生理盐水灌胃,2次/d。3测试指标3.1mna核酸片段的制备主要试剂:c-fosmRNA原位杂交检测试剂盒(天津TBD生物技术发展中心提供)。实验操作步骤:常规脱水,浸蜡,包埋。切片厚度为5um,置于预先用多聚赖氨酸处理过的载玻片上。石蜡切片经常规脱蜡至水。3%双氧水(H2O2)室温处理10min,灭活内源性过氧化酶。切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的复合消化液(1mL3%柠檬酸加入2滴浓缩型复合消化液,混匀),37℃消化5~20min。暴露目的基因mRNA核酸片段。0.5molPBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次。杂交盒中加入5~10mL蒸馏水。每张切片加20uL含CRF寡聚核苷酸探针杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在玻片上。恒温箱37℃杂交30~120min。杂交后揭去盖玻片。30~37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×3次。每张切片取2uL杂交探针稳定液A和18uL杂交探针稳定液B,混匀,加在切片上,湿盒中37~40℃反应20min。2×SSC洗涤5min×3次。滴加封闭液,37℃20min。甩去多余液体,不洗。滴加兔抗地高辛,37℃60min。0.5molPBS洗2min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃20min。0.5molPBS洗2min×3次。滴加SABC,37℃20min。0.5molPBS洗2min×4次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒1mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴,混匀,加在标本上。显色20~30min。苏木素复染,充分水洗。乙醇脱水,二甲苯透明,封片。4mrna显示了大豆诱导肾上腺皮质释放因子crf的出现主要试剂、实验试剂配置、实验步骤同上。5现实动物脑室室旁核中c-fosmrna表达的相对水平采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统(由武汉同济医科大学千屏影像工程公司提供),对各组动物下丘脑室旁核切片进行定量分析。随机选取各组下丘脑室旁核6~7视域,于400倍高倍镜下,以0.2073um像素点长,在1.219×103um2测量窗下,测取棕色反应物的面数密度、总数目、总面积、平均灰度值,分析下丘脑室旁核内c-fosmRNA和CRFmRNA表达的相对水平。测量数据采用方差分析进行统计。6结果6.1各组均实验c-fosmnmna的发现率6.2各组均实验大鼠脑室后果期crfmnmna的发现率7心理应激激活hpa轴对stz大鼠的影响研究证实,应激诱导的c-fos表达多见于室旁核背、腹侧富含CRF和ACTH神经元的小细胞区。Imaki等用c-fosmRNA探针研究PVA在束缚应激后c-fosmRNA水平变化的时程关系,c-fosmRNA及CRFmRNA水平变化的时程关系,c-fosmRNA的最高水平在应激开始后120~180min,且c-fosmRNA和CRFmRNA的表达是同步增加的。根据这些研究资料,有人推测CRFmRNA就是c-fos的下游靶基因,当心理应激发生时,下丘脑首先被激活,在PVN有c-fos和c-junmRNA转录,继而表达FOS和JUN蛋白,FOS与JUN蛋白形成二聚体,作为第三信使与CRFmRNA启动子上AP-1位点结合,激活CRFmRNA,使下丘脑PVN小细胞分泌神经元分泌CRF,启动HPA轴。本实验研究中发现,应激刺激可引起正常大鼠下丘脑室旁核c-fosmRNA转录活动增强,下丘脑室旁核CRFmRNA表达同步增加,尤其STZ+应激组大鼠各项指标的含量增加更显著,推测可能是应激导致下丘脑PVN中c-fosmRNA表达及FOS蛋白合成增多,结果引起其下游靶基因CRFmRNA表达增多,激活HPA轴所致。由于STZ大鼠存在心理和病理双重应激作用,因而各项指标含量增加更明显。因此我们认为不良心理应激诱发2型糖尿病大鼠发病可能与应激激活HPA轴中c-fosmRNA和CRFmRNA在细胞分子水平表达过多有关。针对心身疾病共同的病机为气机失调(主要以气滞、气逆为主)及由其所产生的瘀血、寒结、热结或寒热互结的基本病理变化,同时结合糖尿病自身的病机特点为阴虚燥热,课题组提出理气降逆,散结活血,滋阴清热为糖尿病的基本治则,并拟定心身5号方药。实验结果表明心身5号具有干预心理应激引起HPA通路的激活的作用,间接证实心理应激诱发实验性2型糖尿病基本病机气机失调的客观存在,应激激活HPA轴中c-fosmRNA和CRFmRNA在细胞分子水平表达过多可能是其客观实质。本实验说明心身5号既可整体调整气机,又对具体疾病有所专攻,是治疗心身疾病糖尿病的有效临床方剂。近年来,用心理应激源为刺激,以即刻早期基因(IEG)中的c-fosmRNA的表达作为基因细胞代谢活动标志,对心理应激的脑机制开展了大量的研究。心理应激作用与大脑改变脑的内分泌机能,其中最重要的途径是下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA)被激活,下丘脑室旁核部位的c-fos表达可能作为第三信使调节CRF表达,进而控制ACTH的分泌,启动HPA轴,影响与应激有关的行为、神经内分泌免疫活动。研究证明应激可通过植物神经系统和中枢神经内分泌系统两条途径影响胰岛素抵抗和β细胞功能,进而影响2型糖尿病发生。然而中枢神经内分泌系统如何影响糖尿病发生的通路还未完全明