心力衰竭大鼠下丘脑室旁核活化小胶质细胞nf-的表达及意义

心力衰竭大鼠下丘脑室旁核活化小胶质细胞nf-的表达及意义

近年来的研究表明，在心力衰竭（心力衰竭）过程中释放的高浓度脱甲基硝胺（ne）对心肌细胞有直接毒性影响。加速心肌细胞死亡，恶化心率，提高心率和脉搏节律节律加速的发生率。长期小剂量给予β1受体阻断剂在一定程度上能延长慢性心衰患者的生存时间,所以探索交感神经兴奋性机制成为心衰研究的焦点之一。除此之外,交感神经系统还可促进体液因素的激活,多因素共同作用不断加重心衰的病理过程。因此,交感神经活动增强可能是心衰不断进展的重要原因。研究表明,中枢神经系统参与了交感神经活动的调节。有学者发现,侧脑室注入炎性细胞因子可增加交感神经活动,其中下丘脑室旁核炎性细胞因子水平的升高与交感神经放电增强明显相关,但具体机制报道较少,目前发现促肾上腺皮质素释放激素(CRH)和前列腺素E2(PGE2)可能参与并介导了炎性细胞因子的这一作用。然而,心衰时室旁核炎性细胞因子的来源还不清楚。小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞,它最显著的特点之一就是对外界环境刺激非常敏感,在许多微环境因素发生变化时,小胶质细胞可迅速做出反应,不但出现形态学改变,功能也随之发生变化。因此,下丘脑室旁核炎性细胞因子是否来源于活化的小胶质细胞,是否参与了心衰时交感神经的兴奋作用是本研究的焦点。1材料和方法1.1心肌缺血引发心力衰竭成年健康雄性SD鼠32只,体质量(230±30)g,购于河北医科大学实验动物中心,合格证编号:706124。随机分为2组(n=16),心衰组(HF组)和假手术组(SHAM组)。心衰组行冠脉左前降支结扎术致急性心肌梗死,制备大鼠心力衰竭模型,假手术模型不结扎冠状动脉。大鼠按照戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,经口腔内气管插管,连接动物呼吸机(成都泰盟,HX-300),四肢皮下连接心电图电极进行心电监测(成都泰盟BL-420生物信号记录系统)。采用结扎左冠状动脉前降支方法制作由心肌缺血引发的心力衰竭模型。假手术模型组只穿线不结扎。术中标准Ⅱ导联心电图出现ST段和/或T波抬高或降低,心脏局部颜色变暗等心肌缺血变化作为结扎成功的标志。待大鼠苏醒后入笼饲养。术后给予青霉素(30000U肌肉注射)和丁丙诺啡(0.1mg/kg肌肉注射)。1.2麻醉前准备工作成年健康雄性SD鼠,称体质量后戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉,取右心室、肺脏。用右心室/体质量、肺脏/体质量来反映心衰的严重程度。1.3硬塑管-主动脉间动力学被测大鼠术后4周时戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉,剪开颈部皮肤,分离颈部肌肉,暴露右侧颈总动脉,插入直径约0.5mm的硬塑管至主动脉,硬塑管另一端接成都泰盟生物机能实验系统(BL-420S)记录平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)。然后腹侧面切开暴露肾脏,剥离肾神经,挂于银丝电极,通过生物机能实验系统记录最适合的信/噪声比4h。1.4脑侧脑室等多机溶剂染色(1)采用经心脏灌流法采集脑标本。大鼠行戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后移入灌流室,剪开胸腔,暴露心脏,从心尖部进针,沿心腔入升主动脉,400ml生理盐水冲洗后,改用4%多聚甲醛溶液500ml缓慢灌流。灌流完成后迅速取脑并放入4%多聚甲醛溶液4h,取出,再放入30%高糖溶液至沉底,即可切片。(2)免疫组织化学步骤(sABC三步法)检测脑组织下丘脑侧脑室(PVN)区小胶质细胞的活性。灌流取脑组织,OCT包埋,冰冻切片机切片(14μm),切片后室温放置60min,pH7.2~7.4磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,每次3min;H2O210min,PBS冲洗3次,每次3min;Triton37℃孵育1h,PBS冲洗3次,每次3min;滴加封闭液,封闭20min。加入小鼠抗大鼠CD11b/c单克隆抗体(1:150,美国BDBiosciences公司)置入4℃冰箱过夜。次日PBS冲洗3次,每次3min,加入山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥公司)孵育30min;PBS冲洗3次,每次3min后,再加入辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37℃孵育30min,PBS冲洗3次,每次3min后,每张切片滴加2滴新配制的DAB显色剂,室温下光镜监视其显色3~5min,显色满意后自来水冲洗5min终止显色;之后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,利用图像分析系统进行分析。各组标本同时切片,并同时进行免疫组织化学染色。以确保免疫组织化学条件的一致性。检测脑组织PVN区炎性细胞因子TNF-α的活性。滴加兔抗大鼠多克隆抗体(1:100,武汉博士德公司),I抗山羊抗兔(武汉博士德公司),染色程序同常规免疫组织化学染色。1.5数据分析统计学处理所有数据均以ue0af±s表示,采用SPSS11.5统计学软件对数据进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1两组肺脏器/体质量指数比较假手术组及心衰组大鼠的指标均来自于实验后4周获取的组织标本。心衰组大鼠的右室/体质量指数高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);肺脏/体质量指数高于假手术组(P<0.05)(表1)。术后4周检测大鼠血流动力学,心衰组大鼠左室舒张末压较假手术组明显增高(P<0.05),左室压力最大上升、下降速率(±dp/dtmax)绝对值均低于假手术组(P<0.05),左心室收缩压较假手术组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)平均动脉压无明显差异(P>0.05),见表1,2。2.2心力衰竭大鼠组和肾脏交感神经压结果2.3小胶质细胞tnf-阳性细胞数的变化免疫组织化学结果显示,心衰大鼠和对照组大鼠比较,单位镜下的下丘脑室旁核激活的小胶质细胞数量显著增加,炎性细胞因子TNF-α阳性细胞数显著增加,差异有统计学意义,(P<0.05)。由此可见,充血性心力衰竭时,下丘脑室旁核TNF-α表达增加,小胶质细胞可能是其合成的主要来源。2.4炎性细胞因子tnf-的相关性分析SigmaPlot软件分析,下丘脑室旁核小胶质细胞和炎性细胞因子TNF-α的相关系数r=0.84,有统计学意义。由此可见,充血性心衰时,下丘脑室旁核TNF-α表达增加,小胶质细胞可能是其合成的主要来源。3充血性心力衰竭充血性心力衰竭是临床上常见的心血管病综合征,是多数器质性心脏病患者不可避免的结局。它是一个动态的复杂的级联过程,心力衰竭的特点是呈进行性发展,心脏功能不断恶化直至衰竭,不能满足周身循环和组织代谢需要。现代研究已经证实,交感神经活动增强在充血性心力衰竭发生机制中具有重要作用。交感神经兴奋可使心率加快,并且释放高浓度的去甲肾上腺素促进心衰的病理发展。本研究也证实心衰时交感神经放电增加促进了大鼠心功能恶化,例如:LVEDP升高、±dp/dtmax降低,LVSP降低,右心室/体质量、肺脏/体质量增加。研究表明,下丘脑室旁核炎性细胞因子表达增多是心衰大鼠普遍存在的病理现象,并在其进行性发展过程中起到重要作用。下丘脑室旁核炎性细胞因子亦可使交感神经活动增强。炎性细胞因子是一类由免疫细胞在受到各种生理和病理刺激后合成、分泌的具有生物活性的低分子量蛋白质或多肽,在心血管系统的免疫和炎性反应中起重要作用。以往人们对于心衰的研究多集中在外周炎性细胞因子对心脏的直接毒性作用,即通过介导心室重构、降低心肌收缩力、使β-肾上腺素受体失偶联、引起细胞凋亡等作用引发或加重心衰。而近来研究发现,心衰时下丘脑室旁核炎性细胞因子表达增多促进外周交感神经放电,由此引起的神经体液机制对心衰的发生发展也起着非常重要的作用,其作用可能是通过中枢神经递质PGE2和促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)来介导的,该机制在Kang等近期的研究中得到进一步证实。本实验免疫组化结果显示心衰时室旁核炎性细胞因子(TNF-α)表达增加,交感神经放电活动增强,证实了炎性细胞因子表达增多和交感神经放电活动增强密切相关。目前,对于中枢炎性细胞因子从何而来还不十分清楚。小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统的免疫细胞,通常认为小胶质细胞具有变形运动和吞噬功能,属于单核吞噬细胞系统的细胞;但也有人认为小胶质细胞是中枢神经系统中神经胶质的干细胞,能分化成其他胶质细胞。微环境改变时小胶质细胞被激活成反应性小胶质细胞,反应性小胶质细胞既具有保护神经元的作用,也能分泌炎性细胞因子、补体蛋白等活性物质。本实验免疫组化结果显示下丘脑室旁核活化的小胶质细胞数量增多,炎性细胞因子(TNF-α)表达亦增多。因此我们认为下丘脑室旁核小胶质细胞活化是脑内炎性细胞因子的主要来源之一,该结果提示小胶质细胞激活在充血性心衰中起重要作用。研究表明,炎性刺激可引起小胶质细胞活化,然而心衰患者外周血循环中炎性细胞因子是如何进入中枢神经系统?有学者认为,尽管炎性细胞因子不能穿过血脑屏障,但炎性细胞因子可能激活NF-κB导致室旁核(PVN)微血管表达COX-2。在血脑屏障上皮细胞COX-2催化下产生PGE2。PGE2导致交感神经性血压升高、心率加快和循环血液中去甲肾上腺素(NE)增加。心衰时PGE2进入脑组织可能引起炎细胞因子合成并激活下丘脑室旁核小胶质细胞,使炎性因子表达增加,并激活下丘脑神经元,特别是下丘脑室旁核神经元,激活下丘脑