200920092010年部分猪场猪主要传染病流行病学调查

200920092010年部分猪场猪主要传染病流行病学调查

云南养猪业的发展水平相对滞后。随着其他省份先进的生产技术和管理理念的不断学习，云南养猪业取得了很大进步，但食品疾病的控制和诊断仍是云南养猪业发展的瓶颈。由于规模化高密度的饲养,集约化经营,致使接触性传染性疫病发病增多,危害严重。发病混合感染、继发感染、并发感染增多,必须经过临床诊断、病理剖检和实验室诊断结果综合分析后才能正确做出诊断。如猪瘟、猪大肠杆菌病等旧病依然存在,同时,如猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等新的疫病也不断涌现。免疫抑制性疾病的危害日渐严重。以繁殖障碍为主的传染病普遍存在,而且病因多样。呼吸道疾病日益突出。细菌性疾病发病率增高,治愈率低。疫病的非典型化,病毒毒力的增强与减弱,细菌耐药性变异,导致旧病以新的面貌出现,从2009年4月到2011年1月对送检样品根据临床症状、病理剖检和流行病史确定实验室检测项目,进行实验室诊断,最终统计其阳性检出,为未来云南省常见猪传染病防治措施提供流行病学依据。1材料和方法1.1试剂与检测试剂PCR仪、酶标仪、凝胶成像系统购于BioRad公司,台式离心机购于ThermoHybaid,高速冷冻离心机为HITACHICF16RXⅡ型。Trizol试剂购于大连宝生物工程有限公司。M-MLVReverseTranscriptase反转录酶购于Promega。组织、细胞、细菌、酵母基因组DNA纯化试剂盒,血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购于TIANampGenomic。DNAKit购于TIANGEN公司。EasyTaqTMDNAPolymerase购于TransGenBiotech。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。猪瘟抗原ELISA试剂盒,猪繁殖与呼吸综合征抗原ELISA试剂盒和猪伪狂犬病病毒gp1抗体检测试剂盒(ELISA)购于IDEXXLABORATORIES。支原体抗体ELISA试剂盒购于深圳市某生物科技有限公司。弓形虫间接血凝(IHA)抗体检测试剂盒购于兰州兽医研究所。细菌生化鉴定糖发酵管购于杭州天和微生物试剂有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2方法1.2.1治疗药物治疗用药询问畜主养殖规模、地点、病史、疫苗接种情况和治疗用药等。对病例可视黏膜、体温、皮肤、下痢、精神状态等进行观察记录,而后对病例进行无菌采样和病理剖检。1.2.2制备监狱细菌、固血装置前腔静脉无菌采血,4℃保存。用于检测抗体的全血样品,4000r/min离心10min,取上清分装无菌EP管,-70℃保存。用于细菌、支原体、附红细胞体检测的病料、血样、分泌物4℃保存。动物腋下动脉放血至死,病理剖检,无菌条件采取主要病变器官病变部位,-70℃冻存。送检病料无菌Eppendorf管分装后,-70℃冰箱冻存。1.2.3pcr检测dna感染1.2.3.1实验室检测方法实验室检测方法见表1。1.2.3.2疑似病料检测方法疑似RNA病毒病病料(CSFV、PRRSV)RT-PCR检测方法(吴鑫等,2008)和DNA病毒病病料(PRV、PCV、PPV)的抗原PCR检测方法(李进涛等,2009)。1.2.3.2.1引物设计根据NCBI上已发表的病毒cDNA、DNA代表株的序列(李鹏等,2010;杨玉艾等,2010;曾少林等,2010),设计以下引物(表2)。1.2.3.2.2疑似RNA病毒感染的病料组织总RNA提取与反转录取含毒量高的病料组织0.1g,加入200μLPBS快速研磨后,加入Trizol800μL,充分混匀,接下去操作按Trizol使用说明进行。用30μLRNaseDNase-free水溶解RNA。在50μL反应体积中,加入23μLRNA,4μL通用引物OligodT(10mmol/L),混匀,70℃作用5min,冰浴2min。依次加入以下物质:10mmol/LdNTP2.5μL,M-MLV5×RTBuffer10μL,RNase抑制剂(40U/μL)1μL,M-MLV反转录酶(5U/μL)2μL,加ddH2O至50μL混匀。42℃反应1h,37℃反应10min,4℃冷却备用,-20℃保存。1.2.3.2.3疑似DNA病毒感染的病料组织及血液总DNA提取取含毒量高的病料组织0.1g,加入1mL灭菌PBS洗液,充分研磨,以下步骤参照组织、血液全DNA提取试剂盒说明书的方法进行。用30μLRNaseDNase-free水溶解DNA,4℃冷却备用。-20℃保存。1.2.3.2.4反应体系及PCR循环参数10×EasyTaqTMBuffer5μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,上、下引物(10μmol/L))各1～2μL,DNA/cDNA模板2～3μL,EasyTaqTMDNAPolymerase0.5μL,加ddH2O至50μL。94℃预变性4min;94℃变性30s,65℃→56℃退火30s,每循环降1℃,72℃延伸50s,10个循环;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸50s,20个循环;72℃延伸10min,最后4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。1.2.3.3猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪传染性胸膜炎抗原检测猪瘟抗原ELISA方法检测(曹兴萍等,2008a)、猪繁殖与呼吸综合征抗原ELISA方法检测和传染性胸膜肺炎(支原体)检测,分别参照猪瘟抗原ELISA试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征抗原ELISA试剂盒和支原体抗体ELISA试剂盒说明书进行。1.2.3.4弓形虫抗原检测弓形虫镜检后,使用弓形虫间接血凝(IHA)抗体检测试剂盒,步骤按说明书进行。1.2.3.5病原菌病检查及药敏试验用病料主要病变区涂片,革兰氏染色镜检并划线血平板,分别做37℃需氧和厌氧培养24h,挑取单个溶血疑似菌落革兰氏染色镜检,并纯培养24h,加入300μL灭菌PBS涂板后添加药敏纸片。根据染色特性参照《常见细菌分离鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版和第9版进行生化鉴定试验。1.2.3.6附红细胞体的检查在玻片上滴加200μL生理盐水,再加血液200μL,混匀后盖玻片压片镜检。2病料基因组dna提取和pcv2检测病料的送检时间、地区、数量、主要临床症状和流行病学调查以及检测项目及结果见表3。病料基因组DNA提取结果见图1;病料RNA提取结果见图2;CSFV检测结果见图3、4;PRRSV检测结果见图5、6;PRV与PCV2检测结果见图7;PCV1检测结果见图8;PPV扩增效果见图9,致病性链球菌染色镜检见图10。3临床诊断和诊断的关系本阶段实验室诊断中,对138例病料进行CSFV抗原检测,阳性检出率为22.46%。发病猪多为非典型猪瘟症状。对122例病料进行PRRSV抗原检测,阳性检出率为26.23%。对94例病料进行PCV抗原检测,阳性检出率高达91.30%。120例血样中PPV抗体检测阳性率为63.33%。如何克服多重因素,提高疫苗接种后抗体阳性率,将成为减少母猪大量流产的关键。在42例血样中附红细胞体的检测和39例血样猪肺炎支原体的检测中,附红细胞体阳性率仅为14.29%,说明两种病原可以通过合理应用抗生素有效控制。对56例病料进行细菌病检查,致病菌的阳性检出率为41.07%。畜牧兽医工作者应树立整体的养殖及疫病防疫观念。很多疫病的发生是由饲养管理不规范、不科学造成的。应做好猪群饲养管理,推行多地生产全进全出的饲养模式。实施早期隔离断奶技术。建立猪场完善的免疫程序并加强病原和免疫抗体监测。慎重引种,严格检疫。实施科学、合理的药物预防方案。消毒、杀虫、灭鼠等严格把关。发生疫病后早期诊断,正确诊断。加强兽医机构、防疫队伍、信息平台的建设。只有饲养管理、饲料营养、环境卫生、防疫各环节综合得到提升,才能更好更科学地防疫。兽医工作者应正确认识实验室诊断,虽然实验室诊断科技含量、精确度和效率相对较高,但由于实验室检测运作成本高,不能按照生物统计学要求的试验重复数及样本容量来进行试验设计和操作。实验室人员的操作水平及经验与最终结果准确性高度相关。目前,实验室诊断没有明晰的行业标准和规范,同一病原可用多种方法鉴定,这样才有利于得到准确的结果。兽医工作者应正确认识临床诊断、病理剖检、流行病史调查及实验室诊