血液间相容性的研究进展

血液间相容性的研究进展

各种生物材料在预防和治疗人类心血管疾病方面的应用越来越普遍。对于这些材料来说，其良好的血液适应性是其基本要求。然而目前临床应用的材料仍然存在直接或间接地导致血液成分的改变或血栓生成的现象,因此血液相容性评价研究已成为生物材料科学领域的热点问题。其中最为关注的有:(1)材料与血液间相容性的机理探讨;(2)血液相容性的评价方法和参数研究;(3)血液相容性材料的开发研究。本文就与这几个方面相关的研究进展作一综述。1聚苯乙烯衍生物常用的血液相容性材料有:聚二氧六环硅氧烷、醋酸纤维膜、聚丙烯氰、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚氨酯、各向同性裂解碳、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等。在过去的30年里,对生物材料的研究已由研制和开发不与血小板和凝血因子发生反应的中性材料转向生物活性材料的开发。如肝素化材料,释放一氧化氮的材料、水胶体表面改性物,聚氨基甲酸已酯(PU)、聚苯乙烯(PS)的衍生物等。方法有:(1)表面改性:通过酯键或醚键引入功能基团;(2)接枝共聚。尽管表面改性技术降低了蛋白和细胞在材料表面的沉积,真正意义上的无血栓生成却远未实现。材料血液相容性的优劣主要由材料的表面性能决定,包括:表面自由能、化学基团的分布、异质性、多孔性、光滑度等。在80年代早期,RatnerBD等就研究了聚氨酯材料表面特性对血液相容性的影响,发现表面极性的分布与血小板损伤有关。Brauker等对150多种鼠皮下埋植的不同孔径和化学组成的血液相容性材料进行了体内评价,发现孔径的大小是决定反应轻重程度的主要因素,而化学组成对其的影响很小。ROH等研究了材料内亲水和疏水微结构对其血液相容性的影响。他们采用了不同交联度和亲水性的PU-PS的共聚物进行体外血小板粘附测试,发现降低材料的亲水性和增加交联度,血小板的粘附和活化明显减少。Stanford的材料研究小组对不同材料表面微粒的性状与吸附蛋白之间的关系进行了分析,得出了两点重要结论:(1)微粒的性状决定了材料的蛋白结合模式;(2)粒子表面蛋白的吸附加重了巨噬细胞的激活和细胞因子的释放。2材料-血液作用的生物学基础2.1不同剪切率血小板中cd11b表达的变化一般来说,白细胞和血小板等成分的激活以及这些活化成分向材料表面的聚集过程中剪切力起着关键的作用。不同剪切率情况下,血小板和白细胞的生物行为似有区别。Skarja等用自行设计的锥-板流速计检测了不同剪切率情况下血液中各参数的变化情况。剪切率在170~1000/s之间,血小板被激活程度没有明显差异,剪切力对血小板微粒(MPs)生成的影响还与循环时间有关。当循环时间从5min增加到40min,MPs的释放可增加10~25%。而在白细胞粘附试验中,当剪切率从100/s增加到250/s时,CD11b表达上调,白细胞微粒生成增多。不同剪切率决定了血小板的活化状态。纤维蛋白原(Fg)只有在剪切率为600~900/s时,才能与血小板膜上的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa有效结合。而VWF因子即使在剪切率大于6000/s时,也能与血小板发生结合。当剪切率超过7200/s时,血小板发生聚集。因内学者的研究认为这种聚集似与血小板内CAMP水平的变化有关。2.2凝血过程及下降迄今为止,对血液与材料相互作用的机理已进行了数十年的研究。目前普遍认可的由异物表面引起的凝血过程主要为:在材料表面与血液接触的数秒钟内,首先是血浆蛋白的吸附,随后血小板粘附、激活,同时启动凝血过程中的级联反应,使Fg转变为纤维蛋白,形成血栓。对血液相容性的研究目前主要集中在血小板、白细胞、细胞因子、基质蛋白、免疫系统和血液动力学方面。2.2.1金属离子和丙氨酸对cre-pa基质蛋白主要有纤维蛋白原(Fg)、纤维结合素(FN)、VWF因子、玻璃体结合蛋白(VN)、胶原、血小板反应素等。近来的研究已证实吸附到材料表面的蛋白能影响细胞内的信号传导。Faucheux等选择3T3成纤维细胞建立相容性评价的实验模型,分别测量粘附到铜芬膜(CU)和丙烯氰膜(AN69)上的细胞胞内CAMP水平,发现两者均使CAMP水平升高。加入血清后能阻断这种改变。他们通过抑制剂Echistatin阻断了VN、FN与细胞表面整合素受体的结合,血清的这种抑制效应消失,因而认为吸附到材料表面的基质蛋白与整合素的结合抑制了胞内CAMP途径的激活,防止了细胞聚集,对细胞起到了保护作用。Groth和Altankov进行了亲水、疏水材料—细胞作用界面吸附蛋白(FN,VN等)及其受体功能方面的一系列研究。认为细胞能更好地生长于亲水性材料表面归因于吸附蛋白的数目、构型、重组能力的不同。最新的研究已深入到蛋白受体分布和胞内酷氨酸磷酸化活动的检测,认为不相容的表面抑制了信号传导和随之的细胞内反应。2.2.2血小板聚集近几年对血小板粘附和激活的机制进行了深入研究并取得了一定进展。2.2.2.血小板聚集形成的机理1985年,“血液—材料相互作用的NHLBI指南”中推荐测定材料表面粘附的血小板(密度、形态、数量)作为评价材料血液相容性的指标。随后的几年里,人们主要研究以血小板为指标评价材料血液相容性的优劣。直到最新的ISO10993-4标准,增加了一些更为灵敏的指标,如PF-4、B-TG、GMP-140、GP(SZ-21)等的测定。目前对其的研究集中于粘附和聚集的机理方面,其明确机制尚未解决。但近来研究表明,只有Fg和VWF因子是引起血小板聚集的直接配体,Fg是活化的血小板膜上整合素GPⅡb/Ⅲa的主要配体,而VWF因子在高剪切力的情况下对血小板聚集起主要作用,它与GPⅡb/Ⅲa结合后,血小板流速减慢,并导致激活。血小板上GPⅡb/Ⅲa位点的占据为引发细胞聚集所必需。大多数机制倾向于Fg与GPⅡb/Ⅲa的结合导致血小板的聚集。首先Fg分子对称连接两相邻血小板,此不可逆的结合导致Fg和GPⅡb/Ⅲa构型的改变,细胞骨架丝重组,引发一系列胞内反应。Fg、VWF以外的因子也对血小板的聚集发挥作用。JMGrunkemier等研究了不同基质蛋白对血小板聚集的影响,他们测量了吸附不同蛋白表面的材料引起的凝血酶生成速度和血小板粘附数目,认为在引发血小板粘附方面,FN<VWF=Fg;在血小板活化方面,则为Fg<Fn<VWF。这在随后的HeyuNi的体内动物模型中也得到了证实。他们运用已敲除VWF和Fg基因的小鼠模型评价了其体内血栓形成情况。令人惊奇的是这种小鼠体内的多数血管仍然发生血栓,血小板粒子内FN水平增加了三倍,推测可能在Fg缺乏的情况下,GPⅡb/Ⅲa代偿性的结合FN增多,认为FN蛋白在血小板的粘附和聚集中起着作用。2.2.2.现代协同评价既往认为材料如果不引起血小板的粘附则说明其相容性好。但近来的研究发现单纯的血小板粘附指标评价血液相容性不够充分。现代相容性评价中引入了血小板释放的概念。Hanson等的狗动静脉短路试验结果表明:水胶体类材料的含水量和血小板释放间存在线性关系,这个过程与血管腔的流速、血小板数、肝素的抗凝等无关。Michael等用流式细胞仪观察了体内生物素标记的血小板的释放情况。他们认为只有当材料表面与血液大面积接触时,这种指标的评价才更有意义。2.2.2.血小板—3血小板活化在血小板活化的多种指标中,以血小板微粒的生成和白细胞—血小板聚集最为敏感。材料表面微粒的存在增加了血栓生成的可能。狗循环通路中持续的微粒水平表明MPs是一个良好的体内血小板活化的物理指标。由于其含有丰富的凝血酶原酶,有学者认为微粒的产生使得血小板活化和下游的血栓生成事件发生了联系。Gemmell等用分离的人血细胞分别涂层于PS、PS-PEG材料制成的微球柱上,观察了血小板微粒生成的情况。发现血小板以时间、Ca2+、GPⅡb/Ⅲa依赖性方式发生粘附。血小板—白细胞相互作用已成为评价相容性优劣的新指标。血小板粒子内2~3%P-选择素的表达即足以引起其与白细胞的结合。近来的研究表明血小板-白细胞相互作用可以调控一些与溶血有关的病理生理异常。在装有心脏辅助装置的病人,体内SC5b-9水平与血小板-白细胞复合物呈正相关,此外该复合物还通过组织因子途径间接促进凝血酶的生成。2.2.3补体激活的作用所有的生物材料几乎都能激活中性粒细胞和单核细胞。其中最主要的血栓生成标记是CD11b水平的上调和组织因子的表达。CD11b包括整合素、Fg受体、iC3b和因子Xa,受激后快速转移到细胞表面;组织因子的合成则需要1~4h。许多临床材料都能激活血浆中悬浮的中性粒细胞与纤维蛋白原的吸附。有学者分别将全血与涂层PS、PS-PEG的微球接触2h,发现激活程度与血液—材料接触的表面积和体积的比值有关。补体激活发生于血透、瓣膜置换、心肺旁路手术等多种治疗过程中。升高最明显的是SC5b-9水平以及C3b的裂解产物iC3b和C3d。过去认为材料导致的补体激活仅通过旁路途径起作用。现在发现经典途径也发挥作用。大量的体外试验表明该途径的激活是通过IgG发挥作用的。补体活化对白细胞和血小板的激活产生重要影响。K.Hayashi等在狗体内注射蛇毒因子抑制了C5a的生成,发现粘附到材料表面的白细胞数明显减少。3血液环境的评价血液相容性中最为关键的部分是血栓生成。对于血栓生成还没有较好的单一评价方法,需用多参数的方法。什么是非血栓生成的标志?现代的概念与传统相比,有了很大的变化。现代的概念包括:凝血酶生成率常数(Kp)、低的血小板消耗和激活、低的补体和白细胞激活。血液相容性的评价研究对医疗器械工业的发展有重要作用,但其情况之复杂使得建立一套相关的国际标准也相当困难。目前多利用相关的体内外模型观察血液—材料间的相互作用机理。3.1问题三:kra-pcr检测全血平行板流动室系统是目前最有效的体外模型,用以测定生物材料表面在动静脉切变应力下怎样激活PMN等。近来JaanHong制成的腔模型可对全血进行分子水平上的观察。两个PMMA环固定于玻片上,倒入血液。将一块涂有材料的玻片置于其上,使血液与材料接触。将模型放在转盘上,可以模拟体内血流环境,分析全血各成分的变化。3.2在微血管移植物模拟中的应用体外试验由于观察时间短,加上抗凝剂的使用往往不能准确反应体内情况,因此动物模型的使用对于理解材料和血液间的相互作用显得至关重要。使用的动物有:狗、羊、兔、鼠及灵长类动物等。其中狗的使用最为广泛,其血小板常作为人的血小板模型,较好反映了人体内血小板反应的情况。鼠则多用于微血管移植物试验。在实验方法方面,80年代早期LaurenceHarker和SteveHanson的动静脉短路试验由于创伤小,定量好,结果能较好反映人体情况,并可实现长期监控而沿用至今。目前多数模型仅能评估血栓沉积的情况,而无法监测栓子生成和血液成分激活的过程。最近,HeyuNi应用显微技术建立的血栓模型,结合现代基因敲除技术,可以更为准确地观察动态环境下各种因子对血栓生成的影响。4血液视角材料从第一代血液相容性材料问世以来,已经历了30多年的历程。但迄今为止,真正符合临床需求的仍然很少。由于对血液相容性的研究还主要局限于一般生理和病理学水平,对于相关的蛋白系统和细胞在分子水平上与生物材料是如何作用的,仍然所知甚少,阻碍了我们开发血液相容性材料的进程。华盛顿大学的B.D.Ratner教授在