静电纺丝法制备小口径聚氨酯人工血管及其性能研究

静电纺丝法制备小口径聚氨酯人工血管及其性能研究

人工血管作为血管移植的一种重要的临床药物，在临床上具有重要的应用价值和前景。目前大中口径人工血管的临床应用已取得较为满意的效果,但小口径人工血管由于生物相容性差引起内膜增生不良、力学性能不合适等缺点严重降低移植通畅率。本研究选用具有优良生物相容性及力学性能的聚氨酯(PU)为原材料,以静电纺丝法为制备方法,以期获得具有优良力学性能和生物相容性的血管移植替代物。1材料和方法1.1wst-8、dmso聚氨酯(Sigma,USA);DMF,THF(国药集团化学试剂公司,AR,上海);MTT、WST-8、DMSO(Sigma,USA);小牛血清、胎牛血清、DMEM(Gibco,USA);L-谷氨酰胺、胰蛋白酶(上海生工有限公司);L929(上海生命科学研究院),人脐静脉内皮细胞(HUVEC,上海拜力生物有限公司);e-PTFE人工血管(Gore,USA)。1.2接收装置与实验仪器静电纺丝装置由高压静电发生器、喷液装置和收集装置组成(图1)。装有聚合物溶液的注射器(2)固定于注射泵上,纺丝液由钝端针头(3)流出,针头与高压电源(1)的正极相连,并水平固定于高速旋转的接收装置(4)前方,接收装置接地。通过在针头与收集装置间施加高压,形成强电场,聚合物溶液在电场力作用下拉伸形成喷射细流,随溶剂挥发,聚合物形成超细纤维并在接收装置上沉积。微机控制电子万能(拉力)试验机(深圳市库泰克电子材料技术有限公司);CO2培养箱(SheLL,USA);倒置荧光显微镜(上海长方光学仪器有限公司);自动酶联免疫检测仪(深圳雷杜生命科学仪器有限公司);扫描电镜(Jeol5910Lv,日本)。1.3聚氨酯纺丝液的制备以DMF和THF混合溶液(质量比2∶1)作为溶剂,制备不同质量分数的聚氨酯纺丝液。参考预实验结果设定纺丝过程参数,通过静电纺丝法制备4mm口径人工血管。1.4测试指标1.4.1微观结构观察1.4.2体积、密度取PU人工血管矩形样本,测量样本的长、宽、厚,称量干重(m),计算样本体积(V)和密度(ρ)。代入公式ε=(1-ρ/ρ0)×100%,计算样本孔隙率ε(ρ0为PU的标准密度1.18g/mL)。1.4.3拉伸性能测试制备管壁厚度约为0.2mm的PU管状支架,利用微机控制电子万能试验机测试其拉伸性能。初始测试长度为50mm,以50mm/min的速度匀速拉伸,直至样本断裂,记录各数据。1.4.4细胞耐心检测使用一种已应用于临床的4mm口径e-PTFE人工血管为对照组,研究静电纺丝法制备的小口径聚氨酯人工血管的细胞相容性。1.4.4.1.细胞毒性试验1.4.4.细胞黏附实验结果取铺有PU和e-PTFE样品的96孔板,接种HUVEC细胞悬液培养1、2、3、4h后分别检测两种材料表面的细胞黏附情况,荧光显微镜观察并拍片,每个样品选取9个不同位置的照片,用凝胶成像分析系统图像处理软件分析照片中的细胞数量,同样条件下重复实验3次,取平均值作为实验数据。1.4.4.dmem和wst-8对vec细胞生长的影响取铺有PU和e-PTFE样品的96孔板,接种HUVEC细胞悬液进行培养,每天更换1次培养液,并分别取1组样品,去除培养液后加入DMEM和WST-8,孵育4h后,检测吸光度值(波长450nm)。1.5统计分析方法定量实验数据采用均数±标准差表示,用SPSS11.0软件进行统计分析。纤维直径、孔隙率均数比较用单因素方差分析,生物学检测的数据使用广义线性模型进行统计分析,固定时间因素组间比较使用t检验。检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。2pu人工血管的结构表征本实验通过静电纺丝法制备小口径聚氨酯人工血管60根,内径4mm,壁厚(0.25±0.05)mm,管长(7.0±2.1)cm,外观形貌见图2。经测量本实验制备的PU人工血管的纤维平均直径为(732.72±52.22)nm。当滚轴转速为1000r/min时,纤维具有一定取向,且排列较为规整(图3B)。而当转速低于或高于1000r/min时,收集到的纤维排列杂乱无绪(图3A,C)。2.1孔络率测定本实验研究了不同制备条件—纺丝液质量分数、滚轴转速、管壁厚度对PU管状支架孔隙率的影响。2.1.1不同纺织液的质量比以质量分数分别为8%,9%和10%的纺丝液进行静电纺丝制备PU管状支架,3组支架的管壁厚度相近,约0.2mm,结果见表1。2.1.2种pu不同支架的孔隙率滚轴转速分别为500、1000、1500r/min,制备PU管状支架,测其孔隙率,3种支架的管壁厚度相近,约0.15mm,结果见表2。2.1.3不同壁厚2.2轴向拉伸性能试验结果PU管状支架主要力学性能测试结果(表4),本实验制备的人工血管具有较为均一的力学性能。2.3生物学试验的结果2.3.1e-ptfe-pu人工血管由图4可见两种血管都是由超细纤维构成的三维网状多孔结构,但e-PTFE人工血管是由微米级别的网状纤维及其所连接的结点组成,PU人工血管则是由平均直径(732.72±52.22)nm的多层亚微米纤维叠加而成的三维多孔结构。2.3.3pu人工血管细胞固结实验2.3.4pu-血管细胞培养试验3人工血管的孔隙率静电纺丝法制备的人工血管是由多层超细纤维叠加而成的三维网状结构,随着纺丝液质量分数提高,液体黏度和表面张力随之增大,导致纤维直径升高。本实验制备的电纺支架纤维平均直径为(732.72±52.22)nm,与天然细胞外基质的胶原蛋白纤维尺寸(50~500nm)相近,有利于细胞在血管支架上的黏附和增殖。质量分数为8%的纺丝液在纺丝过程中容易出现珠状纤维,质量分数为10%的人工血管纤维平均直径最大,且在电纺过程中容易出现喷丝口凝结,导致电纺中断。因此本实验将最佳纺丝液质量分数定为9%。人工血管的纤维排列取向对细胞在支架上的生长行为有影响,电纺过程中纤维排列取向受接收装置的滚轴转速影响,当滚轴的表面线速度与射流沉积时溶剂的挥发速度匹配时,纤维以圆周的方式紧密附着于滚轴表面,该速度称排列取向速度。当滚轴速度小于或高于排列取向速度,都无法收集到取向较好的纤维。本实验中的排列取向速度为1000r/min。以该速度作为接收装置的滚轴转速,所得到的人工血管具有良好的纤维取向、排列规整,有利于细胞的黏附和增殖。理想的人工血管还必需具备适当的孔隙率,若孔隙率低,新生内膜的营养难以维持将导致管腔狭窄甚至闭塞。反之,过高的孔隙率则可能引起动脉周围血肿甚至动脉瘤。实验显示人工血管孔隙率受多个因素影响。一方面,纺丝液质量分数升高,纤维直径随之增大,管壁密度增加,导致PU人工血管的孔隙率逐渐下降。另一方面,人工血管的孔隙率与纤维取向及排列密切相关,纤维排列越规整,孔隙率越小。当滚轴转速达到排列取向速度时,纤维取向一致,排列规整,纤维层与层之间排列非常缜密,可显著提高血管的力学性能。高于或低于该速度时血管的孔隙率增加,同时力学性能变差。本实验中,排列取向速度下制备的人工血管孔隙率仍能达到较高水平,同时保证了较好的力学性能。体内血管由于肌肉收缩、运动等原因不断地受到轴向应力,因此理想的人工血管必需具有与人体自然血管相近甚至更好的轴向力学性能。人体股动脉的极限应力为1~2MPa。Vaz等制备的复合支架极限应力为(4.3±0.2)MPa。潘仕荣等制备的微孔血管轴向抗张强度为(1.55~4.36)MPa。本实验制备的人工血管的抗拉性能较均一,无明显落差,轴向抗拉强度为(5.85±0.62)Mpa,高于人体血管承受的压力,具有良好的轴向抗拉性及伸展性能。细胞毒性试验是医用生物材料安全性的有效评价方法。实验结果显示:PU人工血管无细胞毒性,符合生物材料的要求。正常的血管内皮细胞可持续释放生物活性物质、促进纤溶作用、防止血栓形成并抑制SMC增生,因此人工血管植入体内后能否快速内皮细胞化是小口径人工血管能否保持通畅的重要因素。本实验中接触第1、2小时两组细胞黏附量有显著差异,培养第96、120小时两组增殖率有显著差异。表明PU人工血管较e-PTFE的优势在于:有利于内皮细胞早期黏附,可以促进血管内皮化的进程,有利于避免血栓形成、管腔狭窄或闭塞。随培养时间增长,PU人工血管显示出其有利于内皮细胞增殖的优势。综上所述,以聚氨酯为原料,通过静电纺丝法制备的小口径PU人工血管具有良好的三维多孔网状结构,轴向抗拉性能优于自然血管和国内外的人工血管报道,并具有优于e-PTFE血管的细胞相容性,拥有进一步应用于血管移植物研究的前景。扫描电子显微镜观察人工血管的微观形貌并计算纤维直径的平均值。两种人工血管灭菌后,加入含10%小牛血清的DMEM制备浸提液。取96孔板,接种小鼠成纤维细胞(L929)悬液进行培养,测试组加入PU血管浸提液,对照组加入e-PTFE血管浸提液,空白对照组加入新鲜的细胞培养液,阳性对照组加入含50%DMSO的细胞培养液。继续培养24、48、72h后,加入MTT溶液,继续培养4h后加入DMSO,检测吸光度值(波长570nm),代入公式:RGR%=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%,计算细胞相对增殖率(RGR),每组重复3次取平均值。参照六级毒性评级标准将RGR值转换成毒性分级:RGR≥100%为0级,75%~99%为I级,50%~74%为II级,25%~49%为III级,1%~24%为IV级,0为V级。毒性分级为0~I级即可