脑损伤后神经存活的机制

脑损伤后神经存活的机制

0神经胞质细胞分化神经干预的发现为神经系统疾病的治疗提供了新的方向。在适宜的体外培养条件下,从胚胎和成年动物包括人的中枢神经系统培养得到的神经干细胞可分化成神经胶质细胞和各种类型的神经元,将其移植入脑内能够原位分化为神经元和胶质细胞。随着脑损伤发生率的逐年增加,如何提高颅脑损伤的救治水平是神经外科研究的重点。课题利用无血清培养技术,在表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的刺激下培养胎鼠前脑组织,将得到的神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边,观察其在原位的成活、迁移和分化情况。1免疫组化和免疫荧光设计:细胞学体内观察。时间及地点:于2008-05/2009-10在河北北方学院实验中心完成。材料:清洁级孕16dWistar胎鼠2只和Wistar大鼠12只,雌雄不拘,体质量250~300g,由中国医学科学院实验动物研究所提供,动物质量许可证号为SCXK(京)2005-0013,实验中对动物处置符合动物伦理学标准。实验用主要试剂:实验方法:细胞培养:取孕16dWistar胎鼠,在无菌条件下取脑,分离出前脑,制成单细胞悬液。接种于盛有5mL含N2的DMEM/F12培养基的50mL培养瓶中,接种密度为1×108L-1,加入终浓度为20μg/L表皮生长因子、终浓度为10μg/L碱性成纤维生长因子。待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液,按上述条件继续培养,每3~5d半量换液1次,7~10d分离传代1次,方法同前。nestin抗原免疫组化和免疫荧光鉴定:取部分神经球和单细胞悬液,离心后直接涂片检测,或者均匀地接种到预先置有涂布多聚赖氨酸盖玻片的6孔培养板中,并加入含有体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,孵育2h后行抗nestin免疫组化和免疫荧光染色。BrdU标记及其检测:将BrdU加入传代培养的细胞培养基中,终浓度为6mg/L,同时加入终浓度为20μg/L表皮生长因子、终浓度为10μg/L碱性成纤维生长因子,按上述条件继续培养5d。新克隆形成后,将神经球均匀地接种到预先置放涂有多聚赖氨酸盖玻片的6孔培养板中,待神经球贴壁2h后行免疫组化和免疫荧光检测。克隆诱导分化免疫组化及免疫荧光检测:取克隆细胞球,制成单细胞悬液,接种到预先置放涂有浓度为25mg/L的多聚赖氨酸盖玻片的6孔培养板中,并加入含有体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基,按上述条件继续培养7d后,行GFAP,NSE或MAP-2免疫组化及免疫荧光染色。动物模型的建立:实验采用改进的Feeney氏自由落体撞击法来制作创伤性脑损伤模型。12只大鼠按4mL/kg腹腔注入10%水合氯醛进行麻醉,将大鼠固定在立体定位仪上,头部消毒,无菌操作下头皮正中纵向切开,剥开骨膜暴露左侧顶骨,于矢状缝左侧旁开3.5mm、冠状缝后3.5mm处钻一直径6mm的圆形骨窗,注意保护脑膜。将撞杆头端置于骨窗脑膜外,其外垂直金属套管,用30g打击棒沿金属套管从25cm高度自由落下冲击撞针,造成大鼠左侧大脑半球局部脑挫裂伤。再次消毒术区,缝合头皮切口,大鼠放回笼中复苏。神经干细胞移植:移植前5d,向培养瓶中加入6mg/LBrdU培养。BrdU在DNA合成时可被细胞摄取利用而参与DNA的组成,以标记分裂的细胞,当这些细胞移植入脑内后,用BrdU抗体免疫组化及免疫荧光方法可以将含BrdU的细胞检测出来。动物模型建立24h后,行同侧神经干细胞移植。坐标为冠状缝后0.6mm,中线左侧3.5mm插入,硬膜下3.0mm。用微量注射器吸取细胞悬液10μL(细胞数1×1011L-1)。将注射器固定在立体定位仪上,按选好的坐标进针,细胞悬液在10min内注射完,留针10min后,缓慢拔出针头。神经干细胞在体内的存活、迁移检测:取12只神经干细胞移植大鼠,分别在移植后7,14d取6只灌注固定,分别进行BrdU,GFAP免疫组织化学和免疫荧光双染。设计、实施、评估者:实验由第二作者设计,第一、三、四作者实施,第七、八作者进行结果评估,均经过系统培训,未使用盲法评估。2结果2.1传代神经干细胞培养法原代培养的前脑细胞成透亮圆球形,悬浮生长,细胞形态规则,边界清楚,体积较小,折光性较强,胞浆颜色较深,核/浆比值大,1周左右培养瓶中出现有许多由数十到数百个细胞组成的呈悬浮生长的细胞球,见图1a。传代神经干细胞经培养出现与原代培养相同的克隆细胞球,细胞形态不变。传代后,加入血清分化1d,有突起从贴壁细胞团边缘长出,见图1b。2.2神经球的分离和传代直接涂片检测的神经球未发现有突起从细胞团边缘长出,其形态保持完好。贴附于盖玻片上的神经球2h后发现有突起从细胞团边缘长出,传代的神经球中的细胞均呈nestin阳性,表明培养得到的神经球中的细胞具有胚胎源性,且与血清接触后在早期便可进入分化阶段,见图2。2.3神经球的接种加BrdU5d后,可见新的克隆球已形成,新克隆形成后,将神经球均匀接种到预先置放涂有多聚赖氨酸盖玻片的6孔培养板中。待克隆球贴壁后,免疫组化显示新形成克隆球中的细胞均为BrdU阳性,表明克隆球有不断分裂增殖的生物学特性,见图3。2.4胞长和突变织物的形态图4,5可见,细胞贴壁后形态变为不规则,部分细胞长出突起,有的突起相互交织成网状,建立起形态上的联系。免疫组化及免疫荧光检测显示,细胞诱导分化后呈GFAP,NSE,MAP-2阳性反应。2.5brdu阳性检测移植后7d,大部分移植细胞聚集在移植的针道附近及脑损伤灶周边,免疫组化及免疫荧光显示BrdU阳性。随后细胞从移植的针道向附近的脑组织迁移,部分细胞迁移到相对较远的地方,伸出较长的突起,仍显示BrdU阳性。移植后14d,在移植细胞的针道附近BrdU阳性数目有所减少,GFAP阳性细胞增多。脑损伤灶周边远处BrdU阳性细胞散在分布,见图6,7。3神经干细胞移植研究发现神经干细胞具有两个显著特点:一是具有高度的自我更新能力,能够重复进行有丝分裂,产生大量的子细胞;二是在一定的条件下,可诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后。干细胞疗法近年来已成为治疗多种疾病的新策略,神经干细胞移植对于修复受损脑组织是一种有效的治疗方法。实验采用改进的Fenney’s落体脑损伤模型,观察大鼠胚胎前脑来源的神经干细胞移植入脑挫裂伤模型鼠损伤灶周边后,在其周围的成活、迁移和分化。实验结果表明,从胎鼠分离培养出的神经干细胞在无血清培养条件下,由表皮生长因子和碱性成纤维生长因子刺激后,这种神经干细胞能不断分裂增殖,形成神经球,在同样条件下能不断传代形成新的神经球。神经干细胞取材时和神经球传代时,都需要将聚集在一起的细胞分散。很多报道采用酶消化法分散细胞团,实验经过反复比较发现,酶消化短时间无法使细胞团完全分散,延长消化时间却使细胞粘连成索状(DNA释出所致)或大量死亡。实验用巴氏吸管反复机械吹打,手法尽量轻柔,并采用200目细胞筛网过滤,神经干细胞生长良好,经传代后仍具有增殖和分化能力。将BrdU加入到培养基中,作为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)掺入到不断分裂新合成的神经干细胞DNA中,从而标示增殖细胞。神经干细胞缺乏成熟神经元或胶质细胞的特征性标志,但表达一种中间丝蛋白nestin,该蛋白目前已作为神经干细胞的特征性生物学标志被广泛应用于神经干细胞的鉴定。实验在神经干细胞生长的稳定增殖期,即原代培养或传代培养的7~10d获取神经干细胞克隆球,对克隆球和贴壁分化的细胞进行免疫组化及荧光染色,细胞球均为nestin阳性,表明实验培养得到的细胞为神经干细胞。多分化潜能是神经干细胞的一个基本属性,在从培养基中除去表皮生长因子、碱性成纤维生长因子后,加入胎牛血清进行有血清培养,神经干细胞能分化出神经元或神经胶质细胞。在体外贴壁分化过程中,nestin的表达越来越少,出现了神经元的标志性蛋白——神经元特异性烯醇化酶,胶质细胞特征性蛋白——神经胶质纤维酸性蛋白以及微管相关蛋白2,免疫组化结果与免疫荧光结果均为阳性,证明培养得到的细胞具有较强增殖能力,且具有多向分化潜能,能分化为神经元和胶质细胞。神经干细胞移植后在宿主中枢神经系统中的成活、迁移和分化引起越来越多学者们的注意,很多学者对神经干细胞移植后的存活、迁移和分化作了初步研究。Wallenquist等将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞移植到实验性脑损伤后1周的小鼠健侧的侧脑室内,结果显示多于90%的侧脑室移植发现神经干细胞聚集在未损伤侧的侧脑室壁、胼胝体及皮层损伤周围区。在移植后1周观察,其向损害周围区迁移,并且胼胝体和侧脑室壁胶质细胞增多;3个月后损害周围区标记的神经干细胞数量减少,损伤侧的脑室仍可探测到标记细胞。Mine等将由绿色荧光蛋白标记的胚胎源性中脑神经干细胞移植入帕金森病模型大鼠的新纹状体内,显示其存活并分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞,8周后阳性细胞的数量为正常脑移植的3倍,并具有较成熟的神经元形态。Demeter等用神经外胚层干细胞NE-4C经绿色荧光蛋白、耐热碱性磷酸酶和BrdU标记后,植入成年、新生儿和胚胎小鼠前脑观察发现神经干细胞在时间和空间上能够整合到脑组织,移植细胞在胎鼠前脑呈肿瘤样的聚集物伸出;移植入成年鼠脑的干细胞呈神经发生带样生长。Prajerova等将D6启动子增强的表达GFP的小鼠神经干细胞移植入成年大鼠正常脑和光化学损伤脑经免疫组化观察,在体外分化中表达星形胶质细胞标记物,大部分为未成熟的神经元和GFAP阳性细胞,另用膜片钳技术发现这些细胞膜的一些Na+、K+通道与未损伤的细胞相似,移植1周后表达神经元标记物。除了用动物的神经干细胞来进行细胞移植研究外,有的学者对人源性神经干细胞移植也作了研究。Hicks等将人胚胎源性神经干/祖细胞移植入大鼠永久性大脑中动脉远侧段梗死模型的脑皮质内,2个月后用荧光共聚焦显微镜观察,见一部分nestin阳性细胞,另有神经胶质细胞和少突胶质细胞标记物表达。皮质干细胞移植能补偿梗死后脑细胞的丢失。Darsalia等将人胚胎源性新纹状体和皮质神经干细胞移植到卒中后大鼠的纹状体内,首先两种来源的细胞在体外显示出局部特定分化,但在移植入新生大鼠纹状体后存活、迁移和形成神经元相似。两类细胞移植到成年大鼠因卒中损伤的纹状体内1个月后,表现出相似的存活率(30%)并迁移到纹状体各处,源于纹状体的神经干细胞迁移的更远一些,占其容积率更大。在移植核心部位细胞未分化,表达nestin,较少表达GFAP,βⅢ-tubulin,DCX,calretinin及未成熟的神经谱系标记物。用细胞增殖标记物(p-H3和Ki67)显示了在移植片中增殖细胞含量较低,人源性细胞外部分化显示成熟神经细胞形态,并表达成熟细胞标记物。有趣的是纹状体来源的神经干细胞产生一定数量parvalbumin阳性和calbindin阳性神经元,移植的细胞没有分化成星形胶质细胞和少突胶质细胞。因此,人胚胎源性神经干细胞有很强的神经生发能力,可用于神经损伤修复。其潜在的安全性和生命活力有待进一步探讨。实验中将同种大鼠胚胎源性脑皮层神经干细胞植入创伤性脑损伤模型皮质损伤灶周边,观察到移植后1周大部分移植细胞聚集在移植点附近,免疫组化显示BrdU阳性细胞。少量细胞从移植点向相对较远的地方迁移,并伸出突起,与周围组织整合。移植2周后免疫组化和免疫荧光双标检测,移植点附近仍有少量,以及损伤灶周边散在分布一些BrdU阳性细胞。免疫荧光显示GFAP阳性细胞增多。表明神经干细胞移植入宿主脑能够存活,迁移和分化,可与宿主脑组织整合,并能够形成成熟神经细胞形态。实验结果与前述作者一致,但在与人源性神经干细胞移植上略有不同,考虑可能是由于种属差异造成或损伤灶周围微环境影响。现在对神经修复较为困难主要原因并不是神经元本身,而是中枢神经系统内的微环境不适合神经元轴突再生。包括胶质细胞增生形成瘢痕对神经元轴突再生造成空间障碍、促神经生长因子或神经营养因子的缺乏和神经元轴突生长抑制因子的存在等原因。神经干细胞在移植部位分裂增殖,并在局部微环境的作用下分化成相应的细胞而替代受损细胞。移植入创伤性脑损伤模型鼠的神经干细胞是否能对皮质神经溃变的神经元起功能性补充或保护作用?进一步研究正在进行中。神经干细胞移植利益冲突:课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。课题的意义:实验分离培养了胎鼠前脑神