运动训练对慢性心力衰竭大鼠压力反射功能的影响及机制

运动训练对慢性心力衰竭大鼠压力反射功能的影响及机制

慢性心力衰竭（chf）是一种临床综合征，具有通过心脏泵血功能减退而特点的低血压。心衰初期,心输出量降低,导致血压下降,对动脉压力感受器刺激减弱,反射性引起交感神经活动增强,外周血管收缩,提升血压,代偿心功能降低。因此,动脉压力反射(baroreflex,BR)功能减弱是心衰早期的代偿反应。但是,持续的压力反射功能减退引起长时间外周血管收缩,外周阻力增加,则促使心功能恶化,最终进入失代偿阶段。研究表明,压力反射功能降低增加心衰患者的死亡率,预示着不良预后。除了神经因素外,心衰时细胞因子、内分泌激素等体液因素也激活,尤其是血浆血管紧张素II(angiotensinII,AngII)升高,明显抑制压力反射功能,静脉注射AngIIⅠ型受体(AT1R)拮抗剂losartan显著改善心衰动物的压力反射功能。越来越多的研究显示,压力反射调节中枢,如孤束核、延髓头端腹外侧区、下丘脑室旁核等处,AT1R表达在心衰大鼠和家兔均增强,侧脑室应用losartan能恢复受抑的压力反射功能。上述研究提示,脑内AngII是介导心衰时压力反射功能减退的重要机制。近20年来,运动训练(exercisetraining,EX)在防治心血管疾病中的作用逐渐得到重视。在西方国家,运动疗法正逐步应用于高血压、慢性心衰及糖尿病等心血管疾病的康复治疗。EX能明显改善心衰患者的症状,提高生活质量,降低心衰死亡率,但EX改善心衰的机制尚未完全阐明。有研究认为EX通过增强迷走紧张性、降低交感神经活动增强心衰状态下压力反射功能,但也有相反的报道。因此,EX对压力反射功能的影响仍有争议。有报道EX降低心衰家兔血浆AngII并下调延髓头端腹外侧区AT1R表达,但对其它脑区AT1R影响未见报道。本实验将在心衰大鼠模型进一步探讨EX对压力反射功能的影响及其可能机制。材料和方法1素、硝普钠、at1r抗雄性SD大鼠,体重(180-220)g,由美国内布拉斯加医学中心动物实验室提供。苯肾上腺素、硝普钠购自Sigma。AT1RⅠ抗、Ⅱ抗购自SantaCruz,ECL及BCA试剂盒(Pierce)。呼吸机(Harvard),UVP凝胶成像系统(Upland),生物信号采集和处理系统(PowerLab)。跑步机(Columbus)。冰冻切片机(Leica)2方法2.1手术组和对照组SD大鼠随机分成心衰组(n=27)和假手术组(n=24)。心衰由结扎左冠状动脉前降支造成心肌梗死所引起,假手术组除不结扎左冠状动脉外,其余步骤同心衰组。2.2运动训练及坡度左冠脉结扎术后4周,2组大鼠再分成运动与非运动组,4组动物为:心衰-运动(EX-CHF,n=13)、心衰-非运动(CHF,n=14)、假手术-运动(EX-sham,n=12)、假手术-非运动(sham,n=12)。运动训练采用动物在跑步机(treadmill)跑步,1time/d,每周6d,共4周。为了使动物产生耐受性运动,运动时间从10min/d增加到60min/d,履带速度从10m/min递增至20-25m/min,跑道坡度从0%增至10%。运动训练结束后24h检测比目鱼肌柠檬酸合成酶活性,用于评价运动效果。2.3erlp-br压力反射的调节运动训练结束后24-48h,动物在乌拉坦(800mg/kg)和α-氯醛糖(40mg/kg)麻醉下测定BR。左侧颈总动脉插管测定血压,心率由脉搏波触发,血压和心率信号输入PowerLab信号处理系统。分离左侧肾交感神经,置于双极引导电极上,肾交感神经放电(renalsympatheticnerveactivity,RSNA)及其积分信号也输入PowerLab信号处理系统。测定BR时,先静脉注射硝普钠,将动物血压降至50-60mmHg,紧接着静注苯肾上腺素,血压又升至150mmHg左右,反射性地引起RSNA逐渐减弱,甚至完全被抑制。将血压变化和RSNA反应作非线性回归分析,即得到压力反射调节RSNA功能曲线(简称BR曲线)。BR测定后,动脉导管从左颈总动脉向左心室插入,测定左室舒张末期压力。2.4免疫总蛋白水平BR功能测定后,动物处死,迅速取出全脑,干冰速冻,-80℃保存。将脑做冠状切片,在包含室旁核平面的下丘脑脑片上,用16号平针头取下室旁核组织,2侧组织块放在一起作为1例样本。组织样本加入含蛋白酶抑制剂的裂解液,冰上匀浆、超声破碎30s,4℃12000×g离心20min,收集上清液。BCA试剂盒测定上清液中总蛋白浓度,Westernblotting方法测定上清液中AT1R蛋白水平。Ⅰ抗为兔抗AT1(1∶2000稀释),Ⅱ抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG1∶5000稀释)。以GAPDH为内参照,AT1/GAPDH的比值代表AT1R的蛋白表达量。2.5左室心梗面积计算每只动物BR测定后处死,取出心脏,去除大血管、心房和右心室游离壁,沿室间隔纵向剪开左心室,摊平,用视频扫描仪将整个左室面积(包括室间隔)扫描到电脑中,用SigmaScan软件计算出左室总面积和心梗疤痕区面积,心梗面积=梗死区面积/左室总面积×100%。2.6低温离心处理另外4组动物在运动训练结束后24h,乌拉坦麻醉下,颈总动脉抽血2.5mL注入预冷的、含抗凝剂和酶抑制剂的试管,低温离心(4℃3000r/min离心10min),分离血浆,-80℃贮存。采用[125I]放射免疫分析试剂盒(Buhlmann),按说明书进行,γ计数器测定放射强度,通过标准曲线计算血浆AngII浓度。3统计处理数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,各组间比较采用双因素方差分析(Two-wayANOVA),并进行两两比较。结果1cs活性的比较骨骼肌柠檬酸合酶(citratesynthase,CS)活性是评价运动效果的常用指标,EX明显增强两组大鼠比目鱼肌CS活性(P<0.01),见表1。虽然CHF组CS活性低于sham组,但EX-CHF组CS活性得到改善,接近于sham组。表1还显示,EX不影响2组大鼠的血压,但降低CHF大鼠心率和RSNA(P<0.01)。CHF大鼠心梗面积占左室总面积的(37.5±4.8)%,左室舒张末期压力显著高于sham组(P<0.01),EX对2组大鼠的心梗面积和左室舒张末期压力无明显影响。2br曲线斜率和最大增益CHF大鼠BR曲线的平均斜率(图1A)和最大增益(图1B)明显小于sham组(P<0.01),但EX-CHF组斜率和最大增益较CHF组明显增强(P<0.05),且与sham组相比无显著差异;EX-sham组BR曲线斜率和最大增益与sham组相比,差异无显著。这一结果提示,EX能恢复减退的压力反射功能,对正常的压力反射功能无明显影响。3各组大鼠血浆angiii两种方法,传统粗隆压药,sham组图2示CHF大鼠血浆AngII浓度较sham组升高近2倍[(263±55)ng/Lvs(92±21)ng/L,P<0.01),EX显著降低CHF大鼠血浆AngII(137±27)ng/L,P<0.01,但仍高于sham组(P<0.01)。EX呈现降低sham组血浆AngII(75±17)ng/L的趋势,但EX-sham组与sham组相比,差异尚不显著。4sham组与sham组at1r蛋白表达水平比较图3显示CHF大鼠下丘脑室旁核(paraventricularnuclei,PVN)AT1R蛋白水平显著高于sham组(P<0.01),EX降低CHF大鼠AT1R蛋白水平(P<0.05),但对sham组大鼠AT1R蛋白表达无明显影响。br功能曲线及与sham的比较运动训练作为心衰的辅助治疗在国外临床应用已20多年,但运动训练改善心血管疾病的作用机制至今尚未完全阐明。动脉压力反射是维持循环功能稳定最重要的神经调节,以负反馈方式抑制交感神经活动。本实验及其它研究均证实,心衰时BR曲线的平均斜率和最大增益均低于假手术组,表明压力反射功能减弱。有报道,持续的压力反射功能减退引起交感神经活动长时间增强,外周血管收缩、外周阻力增加可促使心功能恶化。相反地,电刺激颈动脉压力感受器,加强压力反射功能,则明显提高心衰犬存活率,这一结果提示,增强压力反射功能对阻止心衰发展至关重要。临床观察证实,EX能有效降低心衰患者肌肉交感神经活动和血浆去甲肾上腺素以及抑制压力反射的心交感神经活动。本实验显示,EX显著增强心衰大鼠BR曲线的斜率和增益,而且EX-CHF组BR功能曲线各参数与sham组、EX-sham相比,差异无显著,这一结果表明,EX能使减退的压力反射功能正常化,这与慢性心衰家兔运动训练后所观察到的结果相一致。本实验观察到,EX降低心衰大鼠升高的血浆AngII,提示降低的AngII与压力反射改善存在某种关联。Mousa等在实验中采用静脉给药方法将血浆AngII维持在高水平,EX则不能恢复心衰家兔压力反射功能,这一结果有力证明了EX是通过降低血浆AngII改善心衰状态下减退的压力反射功能。但血浆AngII影响压力反射弧哪一环节尚不清楚。神经解剖学证据显示,第三脑室室周器包括穹窿下器官(subforinalorgan,SFO)缺乏血脑屏障,能感受血液AngII变化,并将信息传递给PVN。PVN调节压力反射的关键脑区,压力感受器传入冲动经孤束核上行至下后脑PVN,PVN整合外周的传入冲动和大脑皮层、皮层下结构的下行冲动后,传出纤维下行投射到延髓腹外侧头端,调控压力反射功能。有研究显示,心衰时孤束核、延髓头端腹外侧区和PVN等处AT1R蛋白表达上调,EX降低心衰家兔延髓头端腹外侧区AT1R蛋白表达。本研究首次报道,EX下调心衰大鼠PVN内AT1R蛋白表达。因此,降低的血浆AngII作用于下调PVN内AT1R,解除AngII对压力反射整合中枢的抑制作用,从而恢复受抑的压力反射功能。骨骼肌CS活性是评价运动效能的常用指标。本实验显示,运动组(EX-CHF和EX-sham组)比目鱼肌CS活性明显高于非运动对照组,说明所采用的运动训练方案切实有效。虽然CHF大鼠比目鱼肌CS活性低于sham组,但运动后EX-CHF