基于多壁碳纳米管修饰电极的电流型胆碱生物传感器

基于多壁碳纳米管修饰电极的电流型胆碱生物传感器

1聚电解质膜的制备碳纳米管（cnts）由于其独特的性质，广泛应用于生物传感器行业。已经证明,碳纳米管在加速H2O2电催化反应时有电子转移的性质,能提高酶电极对底物的响应电流。Decher等于1991年提出的层层组装技术(layer-by-layer)是指将溶液中带正负电荷的高分子聚电解质或酶分子通过静电力交替吸附到电极表面,形成多层体系膜。聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly-(diallyldimethylammoiumchloride),PDDA)、聚丙烯胺(Poly-(allylamine),PAA)与聚磺化乙烯(poly-(vinylsulfate,potasslumsalt),PVS)为常用高分子聚电解质。利用等电点不同,可以使它们分别带上正负电荷,通过静电力紧密结合在一起,形成通透性好、稳定性强、均匀的膜层。胆碱(choline)是神经系统中重要的神经传导递质——乙酰胆碱的生物合成前体,通常被用于研究脑组织中类胆碱功能活动的标记物,胆碱含量的准确测定具有重要的意义。在Pt电极上将聚电解质和胆碱氧化酶(ChOx)层层自组装已有报道,但还未有将碳纳米管修饰电极和层层自组装相结合制备胆碱传感器的研究。本研究将PDDA和ChOx逐层固定在碳纳米管和(PAA/PVS)3修饰的电极上,本制备方法能精确控制固定酶量,同时较好地保持酶活性,且已有报道(PAA/PVS)3膜可以增强传感器的抗干扰能力,制备的胆碱传感器酶电极具有灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强等特点。2实验部分2.1试剂:pvs,paaPotentiostat/Galvanostat283A型电化学测试系统(美国EG&G公司)。胆碱氧化酶(ChOx,EC1.1.1.17,14U/mg,Sigma公司);PDDA、PVS及PAA(Aldrich公司);氯化胆碱(ChO,上海三爱思试剂有限公司);MWCNTs(O.D.>50nm,长度0.5～1μm,中国科学院成都有机化学有限公司,纯度>95%);对乙酰氨基酚(AP)、抗坏血酸(AA)(Sigma公司);尿酸(UA,Fluka公司);0.10mol/L磷酸缓冲溶液(PBS,pH8.0)。所用试剂均为分析纯。水为二次蒸馏水。2.2动力学电极制备称取1mgMWCNTs置于V(H2SO4)∶V(HNO3)=3∶1的混酸溶液中,超声震荡4h分散成均匀浅黑色溶液,高速离心,反复洗涤使溶液pH接近中性,制成1g/L的溶液。铂电极用0.05μmAl2O3粉磨光至镜面,超声波洗涤2～3min,重复3次,再用乙醇、稀酸和水彻底超声洗涤,晾干备用。将电极浸入MWCNTs溶液中25min,然后取出置于PBS中清洗5min,洗去吸附不牢的MWCNTs,所得即为Pt/MWCNTs电极。2.3电极的制备和清洗酶膜的制备参照文献的方法:首先在Pt/MWCNTs电极上修饰(PAA/PVS)3膜,然后将电极交替浸入2.0g/LPDDA、ChOx溶液中各25min,每次取出后用PBS清洗5min。重复多次,即可制得Pt/MWCNTs/(PAA/PVS)3/(PDDA/ChOx)n酶电极。置于4℃冰箱中保存备用。2.4传感器对胆以及亲碱的检测电化学检测采用三电极系统:以酶电极为工作电极,Ag/AgCl(饱和KCl溶液)为参比电极,铂丝(直径1mm)为对电极。以20mL0.10mol/LPBS缓冲液为电解质,在+0.6V(vs.Ag/AgCl)下测定传感器对胆碱的响应电流,测量时用磁力搅拌器进行搅拌。所有实验均在室温下进行。3结果与讨论3.1cnts修饰电极的制备研究在+0.6V工作电压,0.10mol/LPBS中,MWNCTs修饰电极与裸铂电极对1mmol/LH2O2的电流响应(见图1)。结果显示,经MWNCTs修饰后,电极的响应电流明显增大。这是由于CNTs具有良好的导电性能,可以提高H2O2氧化反应中电子传递的能力;此外,CNTs拓扑缺陷结构的广延性,可以增强其表面含氧基团的活化作用,使通过碳管的电子密度增高,从而使CNTs修饰的电极响应电流增大。传感器检测胆碱的反应原理如下:Choline+2O2+H2O−→−ChOxBetaine+2H2O2(1)Choline+2Ο2+Η2Ο→ChΟxBetaine+2Η2Ο2(1)H2O2→O2+2H++2e−(2)Η2Ο2→Ο2+2Η++2e-(2)通过检测H2O2在电极上的催化氧化电流,即可定量测定胆碱。3.2传感器的循环伏安测试利用循环伏安法检测酶膜在电极表面的生长情况。图2为在含3.0×10-4mol/L胆碱的PBS中测得的被不同层数(PDDA/ChOx)修饰的传感器的循环伏安曲线。在循环伏安扫描过程中,当电极表面吸附的活性物质增多时,在相同的扫描电压下,氧化电流将增大。图2表明,随着(PDDA/ChOx)层数的增多,电极的氧化电流增大,因此电极表面吸附的物质的量逐渐增加,这说明每一层(PDDA/ChOx)都较好地吸附到电极上。3.3酶层数对电流值的影响利用层层组装膜固定酶时,酶电极的响应值与酶层数密切相关。图3表示组装层数不同时,酶电极对3.0×10-4mol/L胆碱时的响应电流。由图3可知,当酶层数为8时电流值最大,继续增加酶的固定量,电流值变小,这是因为过量的酶会阻碍电子的传递。本实验以8层(PDDA/ChOx)修饰电极进行测定。3.4工作电位的测定考察了工作电位对电极响应的影响:在0～+0.6V时,响应电流均随着工作电位的增大而增加;当工作电位大于+0.6V时,响应值开始趋于平稳。这主要因为在+0.6V时胆碱氧化生成的H2O2在电极表面发生氧化反应,产生较多的电子,这与文献一致,所以采取+0.6V作为测定的工作电位。在pH6.0～8.6的范围内,考察了电极对3.0×10-4mol/L胆碱的响应电流(图4),在pH8.0时响应最大,这与文献报道的胆碱氧化酶的最适pH一致,故本实验选择pH=8.0的缓冲溶液。3.5分层传感器检测结果在最佳工作条件下,传感器对胆碱响应的工作曲线如图5所示。当胆碱浓度为5×10-7～1×10-4mol/L时,传感器具有良好的线性关系,其回归方程为i(μA)=0.1443+12.5311C(mol/L),相关系数是0.9932,响应时间7.6s,检出限为2×10-7mol/L(信噪比S/N=3),与已报道的层层自组装制得的胆碱传感器相比,灵敏度和响应电流显著提高,响应时间缩短,同时检出限也得到提高。这是由于CNTs良好的导电性能和宏观隧道效应使其成为固定化酶与电极之间有效的电子介体,而且CNTs对H2O2催化氧化具有增强作用。3.6干扰电流对响应的影响图6是所构建传感器对胆碱、AA、AP和UA的i-t曲线。结果显示,0.1mmolAA、AP和UA的干扰电流分别是0.1mmol胆碱响应电流的1.25%、1.18%和0.9%。在有上述干扰物存在的情况下再次加入0.1mmol胆碱时,传感器仍可对胆碱保持良好的响应。这主要归因于(PAA/PVS)3的抗干扰作用和致密的PDDA多层膜体系的体积排阻作用,而小分子的H2O2可以通过并在电极表面发生氧化反应。3.7碳纳米管生物固化性能对酶电极连续测定30次,电极对1.0×10-4mol/L胆碱溶液的响应电流基本保持不变。