病原免疫学实验：香菇多糖对免疫系统的作用机制

香菇多糖对免疫系统的作用机制Contents1.研究背景2.研究目的

3.实验设计4.检测指标

5.预期结果与讨论

6.参考文献研究背景1969年日本学者千原首次报道了从香菇实体中分离出一种抗肿瘤多糖即香菇多糖。一级结构的β-葡聚糖系由5个β-（1-3）-D葡萄糖残基为主链，2个β-（1-6）-D吡喃葡萄糖苷为侧链组成，高级结构为三重螺旋。正是由于其自身的这种结构决定这种真菌多糖具有高度的免疫及抗肿瘤活性。LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokineactivatedkillercells,LAK）。目前应用LAK细胞过继免疫疗法（adoptiveimmunotherapy）与直接注射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。香菇多糖对小鼠脾LAK细胞增殖及活性的影响研究目的通过研究LNT对荷瘤小鼠LAK细胞的影响，可以从免疫学角度进一步阐明其抗肿瘤作用的机理，对其在临床上的应用有一定的指导意义。建立荷瘤鼠模型将已接种7d肿瘤生长良好的S180腹水型小鼠,抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后123在小鼠右前腋皮下注射0.2mlS180细胞悬液(约2×106

个细胞),制成实体瘤模型。用血球计数板进行活细胞计数,调整细胞数为1×107,制成肿瘤细胞悬液(活细胞率>95%)。分组未荷瘤空白对照组荷瘤阴性对照组荷瘤阳性对照组荷瘤香菇多糖组将接种后的小鼠随机分三组，每组10只：阴性对照组、阳性对照组(环磷酰胺组)、香菇多糖组。接种6h后，各组腹腔注射给药0．1Ⅱ-L／只，阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组给环磷酰胺30rng／Kg、香菇多糖组按0．2mg／P给药。另取10只未荷瘤的同种正常小鼠给予同体积的生理盐水作正常对照。连续10d，于末次给药后24h，摘眼球取血0．5～1．0mL，置于肝素抗凝管中，备用。摘眼球后的小鼠断髓处死，剥离肿瘤组织，剔除净周围结缔组织，称重，计算抑瘤率。摘取脾脏备用。MTT法检测脾LAK细胞活性231脾LAK细胞诱生：无菌取小鼠脾脏，放入盛有冷PBS液的平皿中，剔除脂肪组织后，剪碎，匀浆制成脾细胞悬液，并用淋巴细胞分离液分离收集淋巴细胞，调整其浓度5×106/ml加入1000u/ml的rIL-2，在37℃，5％CO2培养箱中孵育72h。收集LAK胞，调整浓度为3×106/ml。靶细胞：取传代培养的k562细胞系在实验的前一天换液，调整其细胞浓度为1×105／ml。(人白血病细胞K562从白血病急变期的患者的胸水中分离建立的。处于高度未分化阶段；该细胞是对自然杀伤细胞高度敏感的体外靶标，故而被广泛应用于这方面的研究。)脾LAK细胞活性测定：取96孔平底细胞培养板，实验组每孔加入脾LAK细胞及靶细胞悬液各100μl，共做3个复孔。同设脾LAK细胞对照组和靶细胞对照组，均做3个复孔。将培养板放置37℃，5％co2培养箱中孵育24h，每孔加入MTT工作液10μl，连续培养4h；离心(1000rpm，15rnin)弃上清，每孔加盐酸异丙醇100μl，反复吹吸后静置数分钟，置酶联仪上测光密度(OD)值。630nm为参考波长，570nm为测量波长，(OD570-OD630)即为样本的OD值。脾重肿瘤重肿瘤指数脾指数抑瘤率检测指标参考公式1OD值与LAK细胞活性：LAK细胞活性(％)=(1一ODE+T—ODE／ODT)×100％2脾指数：脾指数(mg/g)=脾体质量(mg)/小鼠质量(g);3肿瘤指数与抑瘤率：肿瘤指数(mg/g)=肿瘤体质量(mg)/小鼠体质量(g);抑瘤率=(肿瘤模型组肿瘤平均体质量-给药组肿瘤平均体质量)/肿瘤模型组肿瘤平均体质量×100%。预期结果与讨论1实验结果表明,与肿瘤模型组相比,给药组均有显著的抑瘤作用,肿瘤指数下降。香菇多糖实验组小鼠的脾指数比其他3组均有明显上升2治疗组LAK细胞活性较之模对组明显增强，而模对组脾LAK细胞活性则显著低于正空组，香菇多糖组LAK细胞活性明显增强。参考文献1234《香菇多糖的抗肿瘤和降糖作用机制的研究进展》，张昕,张强,梁彦龙，长春中医药大学药学院，2008《香菇多糖抗肿瘤活性的研究进展》，王万能等，重庆工学院