荧光原位杂交技术在细胞遗传学中的应用

荧光原位杂交技术在细胞遗传学中的应用

dna测序技术dap-fs-fish是一种应用非辐射荧光材料以确定原子能或共青团的位置的方法。该项技术自20世纪70年代后期问世以来已经在很多领域有广泛的应用。它与放射性同位素技术相比具有快速、安全、探针可长期保存等优点。FISH技术正开创着分子细胞遗传学的新天地。1fish的观点自1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后,在二十世纪八十年代逐渐用非放射性半抗原如生物素进行核酸标记,直到1986年FISH技术才被用于分析细胞分裂期染色体铺片的DNA序列,从而开辟了细胞遗传学研究的新方法。从产生到现在,FISH在方法上逐步形成了从单色向多色,从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势,灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。1.1提供了亚染色体区域的生物学和临床意义这是最常见的一项应用,通过识别一个基因在正常和疾病状态下的亚染色体区域可以提供有价值的生物学和临床意义。在某些情况下,绘制一个新发现的基因在染色体的缺失或扩增区与某一特定疾病过程有关的基因定位,可为重要的临床应用提供必要的线索。1.2采用染色质和椰子纤维高分辨率定位1.3dna的立体图像该技术可以观察到细胞周期各阶段细胞核中特殊DNA和RNA靶序列的立体图像。它提供了包括染色体区域排列和结构及单个基因的位置等信息。这些信息对理解分裂间期细胞核中基因组的结构和功能之间的关系非常重要。1.4基因组的研究它是研究染色体异常的一个多基因组筛选技术,研究前可以不了解相关基因组情况。该技术自出现以来已逐渐成为一项可替代染色体显带和荧光原位杂交分析的有效手段。1.5多色fish和光谱核型分析方法的应用使用传统的细胞遗传学现代方法很难确定微小的染色体结构异常。不过,应用多色FISH和光谱核型分析方法可以全面性的进行FISH筛选,它们使用敏感的和不同标记的染色体特异定位探针,能够分析染色体的全部组分以确定未知的异常。2原光源技术的基本方法和优势2.1染色体检测试剂常用的探针是染色体特异性的重复DNA序列,这些序列定位于染色体的着丝粒或端粒,主要用于快速检测染色体单体和三倍体。还有一种常规探针是从基因组DNA文库中分离出来的全长染色体探针,用于染色体的异位或畸变。2.2间接标记方法探针标记有直接和间接两种标记法。直接标记法是将荧光物直接标记核苷酸上。间接标记方法是先在DNA探针上接半抗原物,镜检时再用能与半抗原特异结合的蛋白质进行检测。探针的标记方法有缺口平移、随机引物延伸、体外转录和PCR扩增等几种方法。2.3探针类型的影响杂交前首先双链探针DNA和染色体DNA进行变性,变性温度和时间随着探针类型而变化。杂交在染色体制片上进行,杂交液浓度、pH值、杂交温度等随着探针DNA和染色体DNA最适退火条件而变化。2.4间接免疫荧光法检测检测方法也有直接和间接之分。如用荧光染料直接标记探针,可用直接荧光法进行检测;如果探针使用一个半抗原标记,可通过间接免疫荧光法进行检测。用生物素标记的探针常用荧光素,罗丹明标记的亲和素偶联,再通过生物素化抗亲和素抗体夹层逐级放大信号进行检测。玻片再用碘化丙啶补染,以便在荧光显微镜下观察杂交信号的同时能看到染色体的结构。2.5性同位素标记探针操作简易快速,从收集标本到得出结果只要1到2天时间;采用生物素、荧光素等标记的探针,比用放射性同位素标记探针更为安全;探针标记后稳定,一般可使用2年左右;灵敏度高,应用不同的探针可以显示出某一染色体、染色体片段和单拷贝序列;可在染色体中期相和间期相上观察结果;可以同时检测2种以上DNA的三维结构,制备出染色体的光谱核型,使全染色体的自动化分析得以实现;可用多种显色。3荧光原杂交技术在基因定位中的应用3.1dna和荧光原位杂交目前在癌症基因的检测、癌症判断等方面荧光原位杂交的基因定位技术有着广泛的应用。PP2Ac突变型肺癌相关基因在染色体区域的定位,荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征。结果在正常人淋巴细胞的染色体5q23-31可见明显杂交信号,在GLC-82细胞的5号和7号染色体上出现较强信号。说明点突变引起PP2Ac活性改变,从而基因易位,导致肺肿瘤的产生。在研究膀胱癌时发现5SrDNA(1q42-q43)、1号染色体lp36拷贝数异常,用着丝粒探针可检测到膀胱癌患者3、7、17号染色体出现异常。原癌基因ras在玉米中同源序列的检出及其荧光原位杂交定位时,ras探针在第2号和第7号染色体上均检出了杂交信号,信号检出率分别为10.85%和14.15%,杂交信号与着丝粒的百分距离分别为54.92±1.90和94.62±2.77。做大肠癌新相关基因HSU17714的染色体定位研究时,采用强化荧光原位杂交技术,以生物素化酪胺强化荧光原位杂交信号。结果80.0%(128/160)的间期细胞和59.8%(104/174)的中期分裂相可见到明显集中的HSU17714基因的杂交信号,相应荧光R带分析中,85.1%(40/47)在22号染色体上1区3带处有杂交信号。3.2gfp基因在小麦细胞中的表达转基因技术从产生之日起,就广受关注,发展迅猛,应用广泛。在转基因表达中一个重要的影响因素就是位置效应,即外源基因在受体细胞基因组中的位置不但影响转入基因的表达也影响生物内在基因的结构和表达。如果原位杂交检测显示特异的杂交信号,则表明外源基因已整合到该生物的染色体上。对转基因大麦的gfp基因染色体定位时,发现绿色荧光蛋白(gfp)在大麦的根尖和花粉中均有表达,四倍体的荧光表达强度大于二倍体,表现出基因的剂量效应。gfp基因插入到第6染色体(6H)短臂和另一染色体的短臂近末端。对外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位,结果显示转基因小鼠自F4代起是纯合子,外源基因整合在17号染色体E区,外源基因整合在17号染色体E1.3区,ALK基因第23个内含子区域,说明获得的转基因小鼠为纯系,外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上,并能遗传给后代。3.3原位杂交种roi的基因文库-pcr和小麦的扩增对特殊功能基因的定位是荧光原位杂交技术的最主要应用。用荧光原位杂交技术定位热休克蛋白70(HSP70)基因时,发现150组对虾精巢细胞染色体,有111组染色体有3个杂交信号,占所观察的74%。说明热休克蛋白70基因(HSP70)很可能存在于中国对虾减数分裂细胞3对染色体的3个位点上。以人的原癌基因c-myc和抑癌基因p53的cDNA为探针,对大麦进行染色体定位,结果显示在大麦有丝分裂中期染色体上p53有3个位点被检出,分别位于2L(第二染色体长臂)、2S(第二染色体短臂)和6L上;c-myc有2个位点被检出,分别位于5L和3S上。利用改进的荧光原位杂交技术,使异源单拷贝或低拷贝基因在大麦姐妹染色单体上,同时出现信号的检出率达到了30%以上。从滨麦与普通小麦杂交后代中筛选到一条抗条锈病的小滨麦品系93784。以滨麦基因组DNA为探针的荧光原位杂交结果表明,93784是小麦与滨麦的小片段易位系,易位的滨麦染色体片段位于一对小麦染色体的短臂端部。Connexin31(Cx31)是人类遗传性疾病基因,利用小鼠Cx31基因的cDNA序列探针从小鼠的基因组文库筛选出Cx31的gDNA克隆,并用荧光原位杂交技术将其定位于小鼠4号染色体的中部,这对于小鼠Cx31的基因结构和功能的研究具有很大的帮助。将人糖原脱支酶(基因名为AGL)基因和人第1号染色体与猪第4号染色体同源区域比较,最终定位于猪第4号染色体q16-qter区域,遗传上AGL的缺陷将导致人的糖原贮存病,因此对该基因的定位有助于完善基因的诊断方法。对水稻与其它禾本科植物基因的原位杂交比较定位可以揭示禾本科植物基因组结构的共同特点和进化规律,结果在水稻第11染色体