一株洁净区环境污染菌的分离与鉴定

一株洁净区环境污染菌的分离与鉴定摘要：从无菌药品生产洁净区中分离出一株细菌，通过形态特征及染色观察，结合VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统对其进行种属鉴定，鉴定结果为堆肥土杆菌Geobacillusteobii，为追溯微生物潜在污染来源及无菌药品生产过程微生物污染控制提供参考。关键词：微生物鉴定；堆肥土杆菌；革兰氏染色1概述1.1研究背景《药品生产质量管理规范》2010年修订版，对无菌药品生产过程控制提出了更为严格的要求“应当最大限度的降低微生物、各种微粒和热原的污染，且“产品的无菌或其他质量特性绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）”。因此，对无菌药品生产环境中收集到的微生物进行适当鉴别，能够进一步了解无菌药品生产环境微生物污染状况（微生物种类及分布）。环境微生物的鉴别、统计、分析可以为偏差调查以及污染溯源提供有价值参考信息。此外，持续的微生物监控可用于证明清洗和消毒操作的持有效性。1.2VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统鉴定原理以微生物生化理论为基础，借助微生物信息编码技术，为微生物检验提供了简易、方便、快捷、科学的鉴定程序。2实验材料与方法2.1试剂和主要设备2.1.1试剂和耗材：革兰氏染色液（广东环凯微生物科技有限公司）；芽孢染色液（广东环凯微生物科技有限公司）；VITEK2芽孢菌鉴定卡（生物梅里埃，用于细菌鉴定）；电子比浊仪标准浊度管（生物梅里埃，比浊仪校准与调零）；无菌棉拭子（生物梅里埃，菌株接种）；4.5%无菌盐水（生物梅里埃，制备菌悬液）。TSA无菌培养基（上海诺地生物科技有限公司，菌株培养）。2.1.2主要设备：生物显微镜CX31-12C04（奥林巴斯，用于细菌形态观察）；BSC-13001300HA2型生物安全柜（苏州净化，提供微生物操作环境）；SHP-150型生化培养箱型低温培养箱（上海精宏实验设备有限公司，用于微生物培养）；LDZM-60KCS型湿热灭菌器（上海申安医疗器械厂，生物灭活）；VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统（生物梅里埃美国股份有限公司，菌种鉴定）；DensiCHEKplus浊度仪（生物梅里埃美国股份有限公司，调节菌悬液浓度）。2.2实验方法2.2.1菌株的分离纯化采用自然沉降法，收集洁净区沉降菌。挑取单菌落在TSA固体培养基上连续划线两次分离纯化，以获取待检菌的纯培养物（单个菌落），进行纯培养。2.2.2微生物形态特征鉴别2.2.2.1培养特征：在TSA培养基上观察菌落形态，如形状、大小、色泽、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等。2.2.2.2细胞形态特征：在显微镜下，仔细观察细胞形态，如形状（球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状等）、大小（宽度或直径）、排列方式（单个、成对、成链或其他特殊的排列方式）及有无特殊结构（鞭毛、芽孢、孢子等）。2.2.2.3革兰氏染色将分离微生物进行革兰氏染色，染色后置于油镜下观察染色结果。2.2.2.4芽孢染色将分离微生物进行芽孢染色，染色后置于油镜下观察染色结果。2.2.3VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统鉴定2.2.3.1微生物培养：将待鉴定微生物纯培养物转接至TSA培养基中，置于30~37C18~24小时。2.2.3.2菌悬液制备：在载卡架上放一次性透明塑料试管（75*12mm），每管中加入3mL0.45%无菌盐水，用比浊仪测试管调节菌液浊度为1.8~2.2McF，然后将BCL鉴定卡放在载卡架上，导液管插入到菌悬液中。2.2.3.3上机鉴定：按照VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统操作程序鉴定微生物。3结果与分析3.1微生物形态特征鉴定结果在TSA培养基上，菌落形态特征如图（左）所示，从图片中可以看出，菌落较大，扁平，边缘整齐，奶白色，不透明，表面光滑，湿润。革兰氏染色（图中）结果为蓝色，长杆状，菌体大小一致，两端钝圆，有异染粒，为革兰阳性长杆菌。芽孢染色（图右）结果为，芽孢绿色，椭球型，大多数为内生芽孢，偶有释放至菌体外。以上生化反应结果与堆肥土杆菌Geobacillustoebii相似度为98,鉴定结果为非常好的鉴定。4结论与讨论洁净区内分离出的微生物鉴定为堆肥土杆菌Geobacillustoebii，该菌株为土芽孢杆菌属（Geobacillussp.）的一种。芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的革兰氏阳性杆菌的总称，种类多、数量大，分布极其广泛，其生理特征丰富多样，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群。因芽孢杆菌具有内生芽孢、抗逆性强、繁殖速度快是洁净区主要控制的主要微生物类群。因此，对洁净区环境监测过程中发现的微生物进行鉴定能够为无菌药品GMP生产过程制定有效的控制措施提供依据，并使清洁消毒程序的制定更有针对性。参考文献：[1]GB/T16294-2010，医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法[S].北京：中国标准出版社，2010.户