大粒车前子多糖乙酰化修饰的研究

大粒车前子多糖乙酰化修饰的研究

车前种子是车前植物的干燥成熟种子，具有清热、利尿、保湿、利尿等功效。其种皮外表细胞壁中含有的大量黏液质，被称为车前子多糖，是车前子中的主要有效成分。已有研究证实车前子多糖具有显著的清除自由基、抑制肝微粒体脂质过氧化、促进小肠运动及调节免疫等诸多效用。树突状细胞(dendriticcells,DCs)是体内功能最强的抗原提呈细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。作为免疫调节细胞，DCs功能的发挥与其成熟发育状况相关。成熟DCs分泌大量IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12等促炎症细胞因子及MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-1等趋化因子。这些细胞因子可以使DCs进一步活化，二者形成正反馈。分子修饰是通过化学、物理及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得不同结构类型衍生物的方法，已被广泛应用于多糖构效关系研究中。本实验拟采用化学修饰途径，以乙酸酐作为酰化试剂对大粒车前子多糖(polysaccharidefromtheseedsofPlantagoasiaticaL.,PLP)进行乙酰化修饰。并进一步通过体外树突状细胞模型探究不同取代度修饰产物其对机体免疫的作用功效。其乙酰化反应式如下：同时，也存在副反应：1材料和方法1.1细胞培养和转染大粒车前子产自江西吉安，自然晒干后加8倍体积80%乙醇溶液，浸泡1d，低温烘干，待用。大粒车前子精制多糖：采用水提醇沉法提取大粒车前子粗多糖，经Sevag法去除蛋白质。冷冻干燥即得。所用试剂均为国产分析纯。乙酸酐、NaOH、浓盐酸均为国产分析纯；RPMI1640基础培养基北京索莱宝生物科技公司；胎牛血清美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素(rmIL-4)美国R&DSystem公司；小鼠IL-12p70EILSA检测试剂盒武汉博士德公司。1.2上海仪器、检测方法FD-101S集热式磁力加热搅拌器江苏晓阳电子仪器厂；TDL-5-A离心机上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；NICOLET-5700傅里叶红外光谱仪美国尼高力仪器公司；VarioskanFlash全波长多功能酶标仪美国Thermo公司；ALPHA1-2LD冷冻干燥机德国Christ公司。1.3方法1.3.1调节ph值，反应0.5h参考文献方法，称取200mg车前子精制多糖于具塞试管。室温条件下，将其搅拌溶解于15mL超纯水中。采用10mol/LNaOH溶液调节溶液pH值至9.0，并维持10min。用滴管逐滴滴加乙酸酐。滴加完毕后等待1min，用10mol/LNaOH溶液调节pH值至8.0～8.5。此后，每10min调节1次pH值。如此反复5次，滴加完所有乙酸酐，继续反应0.5h。反应完毕，用10mol/LHCl溶液中和pH值至7.0。收集样品溶液，蒸馏水透析2d，超纯水透析1d，冷冻干燥后即得乙酰化修饰大粒车前子多糖(Ac-PLP)。1.3.2乙酰化改性正交试验为进一步探究大粒车前子多糖最佳乙酰化修饰条件，根据单因素试验的结果，选取乙酸酐体积分数、反应温度、反应时间进行三因素三水平正交试验。1.3.3红色消失或取代度的测定称量乙酰化大粒车前子多糖20mg，加入10mL0.01mol/LNaOH溶液溶解，加热至50℃并维持2h，期间剧烈振荡。以酚酞作为指示剂，用0.01mol/LHCl溶液反滴定至红色消失。取代度(DS)按下式计算:式中：A为乙酰基含量/%；V0为加入NaOH溶液的体积/mL;C0为NaOH溶液的浓度/(mol/L);V1为消耗HCl溶液的体积/mL;C1为HCl溶液的浓度/(mol/L);m为样品质量/g。1.3.4细胞培养及培养基的制备颈椎脱臼处死BALB/c(I-Ad)小鼠，75%酒精浸没10min。于无菌超净工作台中取股骨、胫骨。剔除肌肉和结缔组织之后，剪开两端骨骺。用RPMI-1640基础培养基冲出骨髓细胞，收集细胞悬液。采用红细胞裂解液裂解红细胞，置37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养2.5h后，吸弃基础培养基。加入含有rmGM-CSF(20ng/mL)和rmIL-4(10ng/mL)的RPMI-1640完全培养基(含有体积分数10%的胎牛血清)。隔天更换75%培养基。收集培养至第5天的悬浮及半贴壁细胞，即得未成熟DCs。1.3.5elisa检测细胞培养中il-12p60的表达收集未成熟DCs，以1.5×106/mL，接种6孔板中，2mL/孔。加入不同取代度乙酰化修饰大粒车前子多糖，终质量浓度为100μg/mL。刺激培养24h后收集各组细胞，离心取上清液。ELISA检测细胞培养液上清液中IL-12p70的含量。实验同时设置RPMI1640完全培养基阴性对照组，和LPS(1μg/mL)阳性对照组。2结果与分析2.1单因素试验大粒车前体葡萄糖乙酰化改造2.1.1乙酸酐体积分数对乙酰化取代度的影响为考察酰化试剂乙酸酐剂量对大粒车前子多糖乙酰化修饰的影响，在40℃水浴中，分别按体积分数2%、4%、6%、8%、10%加入不同体积的乙酸酐，反应2h，结果见图1。如图1所示，乙酸酐体积分数在2%～8%范围内，随着乙酸酐体积分数的增加，乙酰化取代度增加。而乙酸酐体积分数在8%～10%时，取代度突然明显下降，这可能是由于乙酸酐水解副反应程度加大，反应体系pH值迅速降低所致。2.1.2反应时间及时间采用6%乙酸酐，分别于30、40、50、60、70℃条件下进行反应，反应时间2h。如图2所示，随着温度的升高，乙酰化取代度逐渐下降，这一方面是由于乙酸酐水解速度加快，另一方面是由于碱性环境中乙酰化多糖皂化分解加剧。2.1.3乙酰化修饰反应碱性环境中，多糖羟基首先形成醇盐，然后进一步作为亲核基团攻击乙酸酐的羰基碳原子，得到多糖乙酰化取代产物。本研究采用6%乙酸酐，于40℃水浴中进行乙酰化修饰反应，反应分别进行0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，结果见图3。如图3所示，乙酰化取代程度在0.5～1.0h范围内显著升高。但反应时间继续延长至2.5h范围时，取代度变化不明显。说明多糖在反应初期0.5～1.0h主要处于生成醇盐的阶段，而进行到1.0～1.5h时主要发生亲核取代反应，反应进行至2.0h后基本完毕。2.2反应时间的影响如表1所示，影响多糖乙酰化反应取代度的主要因素为反应温度和乙酸酐体积分数，而反应时间的影响很小。最佳乙酰化条件为乙酸酐体积分数10%、反应温度30℃、时间2.5h。正交试验中试验7条件取代度最高也与此结果相一致。2.3cb波和plp吸收峰分别将PLP、Ac-PLP(DS=0.027和DS=0.11)和溴化钾研磨压片后，红外光谱仪进行测定，结果如图4所示。由图4可知，在3400cm-1波段附近的宽吸收峰是O—H的伸缩振动；3000～2800cm-1波段处的吸收峰是糖类C—H的伸缩振动；1735cm-1波段附近的吸收峰是酯基的C=O伸缩振动；890cm-1波段附近的吸收峰是吡喃糖β型C—H弯曲振动的特征吸收峰。与PLP相比较，Ac-PLP在1735～1729cm-1波段处的吸收峰随着乙酰基取代度的增加而增强，这说明存在乙酰化修饰成功。此外，O—H伸缩振动强度远远大于C=O伸缩振动，说明乙酰基的取代度比较低。2.4不同ac-plp处理的il-12p70的分泌量DCs是机体内专职抗原递呈细胞。不成熟DCs捕获抗原、加工和处理抗原，同时DCs逐渐发育成熟，并通过高表达MHC分子、共刺激分子，分泌多种细胞因子启动免疫应答。DCs分泌的IL-12能够诱导Th0细胞分化为Th1细胞，在Th0细胞分化过程中具有重要影响。在体外通过细胞因子联合诱导方式培养获得大量小鼠骨髓DCs，分别加入取代度为0.027(Ⅰ)、0.059(Ⅱ)、0.082(Ⅲ)、0.11(Ⅳ)的Ac-PLP共同培养48h。ELISA法检测培养上清液中IL-12p70的分泌情况。如图5所示，Ac-PLPⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组IL-12p70分泌量分别为(33.11±5.61)、(60.51±3.19)、(96.43±7.69)、(81.06±7.44)pg/mL。与空白组((20.38±3.50)pg/mL)相比，各组多糖均能刺激IL-12p70分泌。而与PLP((49.97±10.02)pg/mL)组相比，Ac-PLPⅠ组分泌量显著降低，Ac-PLPⅡ组略有增加，Ac-PLPⅢ、Ⅳ组分泌量显著增加。另外Ac-PLPⅣ组分泌量明显低于Ac-PLPⅢ组。以上分析说明，大粒车前子多糖经乙酰化修饰后，在DS为0.06～0.1范围内，其促进DCs分泌IL-12p70能力均增强，且在DS为0.08左右时达到最大。进一步提示对大粒车前子多糖进行乙酰化修饰能有效促进其免疫活性的发挥，从而可作为其改性方向，开发出大粒车前子多糖相关功能性产品。3乙酰化修饰对多糖合成的影响多糖是一类具有丰富结构多样性的特殊生物大分子。大量研究报道表明，多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种功能，是一种重要的生物活性成分。多糖的化学结构是其生物活性的基础，而构效关系已成为当前糖化学和生物学共同关注的焦点问题。目前，多糖构效关系研究主要包括糖单元的组成，糖苷键的类型，主链、支链、空间的构型，取代基的种类及数量、分子质量等。随着研究的不断深入，通过分子修饰来探讨其生物活性的变化的方法已成为多糖构效关系研究中的强有力的手段之一。同时，分子修饰也可以进一步改善多糖的生物活性，甚至获得具有特定结构和功能衍生物。乙酰化修饰是一种常用的分子修饰方法，它能够改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变糖链的空间排布。目前，对乙酰化修饰多糖的活性研究已有部分报道，如乙酰化修饰能增强茶多糖的抗凝血活性；双歧杆菌胞外多糖经酰化修饰后刺激小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ细胞因子的能力显著提高；坛紫菜多糖经乙酰化修饰抗氧化能力加强；而蛹虫草多糖经修饰后抗氧化能力