蛋白质复性的条件及影响因素-cropped

蛋白质复性的条件及影响因素_cropped摘要蛋白质复性是一个过程,存在中间阶段,此阶段的各种相互作用力决定了蛋白质能否复性。蛋白质复性要求有一定的条件,如pH、温度、离子强度、蛋白质浓度等。另外多种添加剂能促进蛋白质复性,其中包括表面活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对,但对于不同蛋白质,因其结构及理化特性不同,采取不同复性方法,可以使其达到最佳复性效果。关键词蛋白质;结构与复性蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分,某些脯氨酸异构酶在含有脯氨酸的变性蛋白结构质中被证明对复性有辅助作用。来源于不同物种中子物质,易受外界条件的影响发生变性。随着基因的同一蛋白质在氨基酸排列顺序上会存在不同程度工程技术的发展,许多实验通过将目的蛋白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方法,得到需要的差异,但其折叠方式却有很大的保守性。Wal23的蛋白质,这大大丰富了蛋白质的来源。但这些蛋lace研究了来源于大肠杆菌、人和乳酸杆菌的二氢白质,由于表达体系本身的原因,或实验过程的处叶酸还原酶的复性,虽然这3种蛋白在氨基酸顺序理,多以无活性的却具有相同的复性途径和两对蛋白质复性的研究必然的成为从基个中间体。蛋白质的空间结构由一系列化学键来维物工程研究到最终临床应用过程中不可避免的一系,其中二硫键是维系蛋白质结构完整的重要共价步。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研键,二硫键的错误搭配会引起蛋白质高级结究作一综述。构的丧失,恢复二硫键结构是蛋重要一步。在蛋白质的复性过程中,存在一形式存在,需要进行复性。因此,上只有30%相同,但是础的实验室生打开或白质复性的系列的结构相1蛋白质的结构与复性,这些中间体分子表面有许多疏水基团似的中间体蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常暴露,对聚集较敏感,易于形成沉淀。同时,分子内复杂的空间立体结构,其组成中的氨基酸本身的特部氨基酸之间存在使蛋白质正确折叠的天然作用性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础,力,蛋白质的复性过程就是这些中间体向两个方向尤其是处于关键部位的氨基酸,对蛋白质的生物学4选择性的演变过程,蛋白质复性效率就取决于正功能有根本的影响,例如镰刀型红细胞贫血症中血确折叠和变性聚集之间的竞争。疏水链暴露后,肽红蛋白氨基酸的变化。因此,能达到复性的蛋白质变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不

变的基链上某些具有光吸收作用的氨基酸也暴露于溶液础上,由于其他因素的影响而引起的分子高级结构中,会引起蛋白质紫外吸收值发生一定的变化,根据αβ的变化,如2螺旋、2折叠结构的增减,肽链的变性这一点,可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进舒展,杂乱结构的增多,从而使蛋白质正常的生物学行观察。蛋白质的变性过程发生是比较迅速的,只活性丧失。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有要几分钟,但复性过程却相对较慢,需要几个小时,关系,例如含有巯基的氨基酸,最常见的是半胱氨因此,复性时要给予足够的时间。酸,会降低蛋白质在高温条件下的稳定性,尤其在某+2+些金属离子,Cu、Zn等存在时,蛋白质对空气中2蛋白质复性条件1的氧更为敏感,而易发生不可逆变性,在此基础上,有人通过用丝氨酸、丙氨酸替换活跃的半胱氨酸蛋白质的复性对环境中的求,复性时必须对温度、pH、离子强度等进行严格的响蛋白质的生物学活才有意义。脯氨酸限制,同时蛋白质本身的性状也对复性效率产本身存在顺反两种异构形式,也会影响蛋白质空间5响。朱慧等在研究重组人前尿激酶复性时,对不同复性条件进行实验比较,发现强酸强碱均不理化条件有很高的要2的方法来提高蛋白质的稳定性,这当然要在不影性的基础上生影利于(())蛋白质复性,偏碱pH8.6,8.8、低温4?情况下11Hevehan的研究表明,这一比例关系需随蛋白质,浓蛋白质复性较好。蛋白质浓度对复性也有影响6度越低,聚集越不易发生。原因是由于蛋白质的浓度作调整,实验中还原型和氧化型巯基试剂比例浓度上升时,分子间相互碰撞的几率增加,处于中间介于3?1,1?1之间时,蛋白质达到最大复性。空12状态的蛋白质对聚集又较敏感,使蛋白质趋于凝集气中的氧是很好的二硫键催化剂,Menzella等的而不能正确折叠,已复性后的蛋白质分子不易发研究成功地利用空气中的氧使前凝乳酶原达到复生聚集。但是,实际的应用要求在高浓度下达到蛋性,复性中需要监测溶液pH值,而且适量加入精氨则酸和中性表面活化试用改变实验步骤的方法来克服这一问题。朱慧等应用的方法。种降低复性成本时间间剂可提高复性效率,这不失为一白质的复性,许多人尝将复性分步进行,在一定的,有望在大规模生产中隔下分步加入蛋白质,给蛋白质有效的时间利用空气中的氧复性时,金属离子往往被用来作为进行低浓度下的复性,结果提高了复性效率,并比较催化剂。7不同的时间间隔,发现60min为最佳。周明乾等312分子伴侣对复性的影响

()在纯化白介素22IL22和粒细胞2巨噬细胞集落刺激分子伴侣是一种较新但已屡次得以验证了的蛋()因子GM2CSF融合蛋白时,对溶解变性包涵体通过白质复性辅助剂。它能结合和稳定解链或半折叠的()一步稀释80倍和分步稀释法分别进行复性,前种蛋白质结构,降低蛋白质聚集并有效促进蛋白质折方法目的蛋白有析出,回收率低,其原理也是通过避叠。目前已从不同来源得到多种分子伴侣并应用于13免高浓度的蛋白质中间体同时存在于溶液中。蛋白蛋白质复性,Nam从大肠杆菌中诱导并纯化得到质分子正确折叠对溶液的离子强度也有要求,适当Dnak,Dnaj,GrpE,GroEL,GroES5种分子伴侣,它们盐浓度有利于蛋白质内部各种化学键的形成。能促进碳酸酐酶B的复性。分子伴侣的复性机制8Tayyab用1.0mol/LKCl显著提高了在脲素中变性与ATP关系密切,GroEL与目的蛋白结合后,随即与9的牛血清白蛋白的复性效率。国内孙叶芳对在大GroES结合,两者共同为蛋白质肽段提供一个封闭()肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白的折叠环境rhBMP22,然后结合ATP,GroEL结构发生改变,进行纯化及复性时,结果显示高盐不能使rhBMP22释放出蛋白质进行复性。另外发现,GroEL还会改14获得良好复性,其他条件相同时,0.75,1.25mol/L变蛋白质复性途径。Hsp78存在于酵母线粒体的NaCl最有利于蛋白二聚体的形成,活性最高,因中,具有水解ATP及发挥分子伴侣作用,在ATP的此,溶液中的也是蛋白复性中应盐考虑的一项重要参与下,Hsp78与Sclp、Mdjlp、Mgelp协同作用可使荧15(αα)光蛋白复性。2晶体蛋白2crystallin是一种小因素。()分子量的蛋白质16,30kD,在所有物种中均有表3复性的辅助剂16α达。Keyang的实验中2晶体蛋白和变性的萤光变性后的蛋白质由于氨基酸的完整顺序没有变素酶结合后,在ATP的预先作用后再加入Hsp70,2h化,本身自然存在着向活性蛋白折叠的趋势,有许多α后萤光素酶活性恢复,ATP的结合引起2晶体蛋白蛋白质用透析等方法去掉变性环境后,自身即可完结构的变化,释放出目的蛋白,以利于其他分α发挥作子伴侣成复性过程,最为典型的如核糖核酸酶,但对多数蛋17用。Nathy用2晶体蛋白对木聚糖合酶进白质来说,复性需要一些辅助剂的加入。这些添加行复性,并检测复性过程中蛋白质结构的变化情况,剂具有分子量小、易于和蛋白质结合、较稳定、不易

聚集等优点。其作用机制不尽相同。α2晶体蛋白先与木聚糖合酶中间体结合形成一无α活性的“融球”状复合物,加入ATP后,2晶体蛋白311二硫键催化剂的结构发生变化,释放出目的蛋白。他们还发现,各种氧化还原对可以使二硫键在正确位置上氧2+Ca可以提高酶活性的恢复,虽然体内木聚糖合酶化形成,象cysteine/cystine、GSH/GSSG。用此进行复2+的复性并不需要Ca参与。由此可见,蛋白质复性性时,不同氧化还原物质之间的浓度比例是决定蛋9中分子伴侣的结合遏制了蛋白质的聚集,而ATP的白质复性的重要因素。孙叶芳对纯化出的加入可使分子伴侣将目的蛋白由结合态游离出来,rhBMP22单体按不同实验条件分8组进行复性,发进行折叠,而且,多种分子伴侣对复性有协同作用。()(现在10?1条件下的GSH2mmol/L和GSSG0.2在分子伴侣作用机制的基础上,有人用人工分子伴)mmol/L能最大程度的促进rhBMP22的活性恢复。10侣系统对蛋白质进行复性。人工分子伴侣由去垢剂在蛋白质hainantoxin2IV.的复性中,也验证了这和环糊精组成。去垢剂可以与蛋白质结合,形成复()一点GSH:5mmol/L,GSSG:0.5mmol/L。最近,合体,抑制蛋白质聚集,然后环糊精从复合体中它们的分子内部大都含有C=N、C=S等类似共价参考文献()(键结构,如盐酸胍和精氨酸C=N,二甲基亚砜S1SandbergAetal.Biochem,2002;41:1060)()=O,乙酰化环糊精C=O等,这种结构可能与蛋2Kretschmaretal.MolBiol,1999;291:1147白质疏水基团的结合有关。在对蛋白质进行透析复()3WallaceLAetal.JMolBiol,2002;3152:193性的基础上,可适当应用这些添加剂。()4CapaldiAPetal.NatStructBiol,2002;93:20954工程蛋白质的复性()ZhuHetal.ChinMedJ,2001;1142:186方()敏等.生物工程学报,2001;176:608林来6从组织器官中消化提取可以得到蛋白质,但往兴妹等.第一军医大学学报,2001;4:2457往产量较低,方法复杂,随着基因工程技术的发展,()TayyabSetal.JBiolMacromol,2002;301:178利用原核或真核表达体系表达蛋白质的方法可以解孙叶芳等.牙体牙髓牙周病学杂志,2001;2:739决这一问题。原核表达体系具有易控制、周期短、产()刘中华等.生物化学与

生物物理学学报,2002;344:10量高的优点应用较多。但由于自身的特点,加上蛋516白质的高产量表达,得到的蛋白质多以无活性不溶HevenDL,ClarkEDB.BitechnolBioeng,1997;54:22111的包涵体的形式存在,对于此类蛋白质要先经过变()MenzellaHGetal,ProteinExprPurif,2002;252:24812性溶解后再恢复活性。由于菌体中成分复杂,含有()NamSHetal.ProteinExprPurif,2002;242:282一些蛋白酶等对蛋白有害的物质,因此对包涵体进13BhutaniNetal.JMolBiol,2001;314:1167行洗涤以除去这些杂质是非常必要的。蛋白质的纯14度对复性也有影响,高纯化的蛋白质更易达到复性。KuzewskaJetal,JMolBiol,2001;314:90115许多实验中,在目的蛋白的一端可以连上一段小的WangK,AbrahanSpector.EurJBiochem,2001;268:6335161920肽段,如:组氨酸、谷胱甘肽2S2转移酶等,然后()NathDetal.ProteinSci,2002;1111:272717用镍螯合的层析柱进行特异性的纯化,一方面大大()DongXYetal.BiotechnolProg,2002;183:66318提高了所得蛋白质的纯度,另一方面,由于柱本身对()GrayLRetal.ExprPurif,2002;261:17919蛋白质起一定程度的隔离作用,许多蛋白质在洗脱()ChoTHetal.Bioseparation,