生殖生物学理论与相关技术：04 受精的细胞与分子机理

受精的细胞与分子机理

CellularandMolecular

MechanismsofFertilization一、两性配子在受精前的准备（一）精子的准备精子的发生——

睾丸精子的成熟——

附睾精子的获能——

女性体内（二）卵子的准备二、受精的细胞与分子机理

（一）顶体反应（二）精子与卵子(透明带)的识别（三）精子与卵子膜的融合（四）卵子的活化、两性原核的形成与融合一、两性配子在受精前的准备（一）精子的准备精子的发生——

睾丸（72天）精子的成熟——

附睾（14天）精子的获能——

女性体内（5-6小时）卵子：等待于输卵管壶腹部精子的使命:(1)运动到达输卵管壶腹部；(2)将携带的DNA送入卵子；精子卵子睾丸卵巢精子的发生(spermatogenesis)部位：睾丸形态上的变化核蛋白的变化精子代谢的变化形态变化（一）生精细胞精原细胞（spermatogonia）：紧贴基膜，圆形或卵圆形，直径约12m分为A、B两型精原细胞A型：核卵圆形，染色质细小，染色深；或染色质细密，染色浅。是干细胞，能够不断分裂增殖，一部分子代继续作为干细胞，一部分分化为B型B型：核圆形，核周边有较粗的染色质颗粒。B型精原细胞经过数次分裂后，分化为初级精母细胞2.初级精母细胞（primaryspermatocyte）：位于精原细胞近腔侧，圆形，体积较大，直径约18m核大而圆，核型46，XY初级精母细胞经过DNA复制后（4nDNA），进行第1次减数分裂，形成两个次级精母细胞3.次级精母细胞（secondaryspermatocyte）：位置近腔面，圆形，直径约12m核圆形，染色较深，核型23，X或23，Y(2nDNA

)次级精母细胞不进行DNA复制，迅速进入第2次减数分裂，形成两个精子细胞，核型23，X或23，Y(1nDNA

)。生精小管中不常见到次级精母细胞减数分裂仅见于生殖细胞发生过程4.精子细胞（spermatide）：位于近腔面，直径约8m核圆，染色质细密经过精子形成（spermiogenesis），由圆形变为蝌蚪形的精子——

核浓缩，成为精子头部的主要结构

高尔基复合体形成顶体（acrosome），位于核的一端

中心粒迁移到顶体对侧，微管延长，形成轴丝，成为尾部（鞭毛）的主要结构

线粒体聚集，包绕轴丝近端，形成线粒体鞘

多余的胞质汇聚在尾侧，称残余体，后脱落5.精子（spermatozoon）：人精子蝌蚪状，长约60m；分为头、尾两部头部嵌入支持细胞的顶部胞质中，尾部游离于生精小管内头部正面观呈梨形，长4-5m头内有高度浓缩的核，核的前2/3有顶体覆盖顶体含有溶酶体酶：顶体素、透明质酸酶等尾部是运动装置，可分为颈段、中段、主段和末段尾内部全长是轴丝，由9+2排列的微管组成；中段的轴丝外有9根纵行外周致密纤维，外侧再包有一层线粒体鞘；主段最长，外周有纤维鞘；末段仅有轴丝人精子发生（spermatogenesis）644.5天

精原细胞：A型B型A型分化分裂初级精母细胞：46，XY次级精母细胞:23,X/23,Y精子细胞:23,X/23,Y精子发生精子形成精子:23,X/23,Y精子发生精子形成及精子结构由一个精原细胞增殖分化所产生的各级生精细胞，其胞质并未完全分开，有胞质桥（intercellularcytoplasmicbridge）连接，形成同步发育的细胞群，称同源细胞群（isogeneousgroup）SpermatogoniaPrimarySpermatocytesSecondarySpermatocytesSpermatidsSperm形态变化精原细胞初级精母细胞次级精母细胞精子细胞精子NucleusHead

核头GolgicomplexAcrosomeCentriolesFlagenumMitochondrionHelixCytoplasmResidualbody

形态变化高尔基体顶体

中心粒鞭毛线粒体螺旋鞘细胞质残余体spermiogenesis形态变化精子发生过程中核型的改变核蛋白变化SpermatogoniaPrimarySpermatocytesSecondarySpermatocytesearlystageSpermatidselongatingSpermGermcellNuclearproteinHistone（组蛋白）Protamine（精核蛋白）

核蛋白转型转型的意义合成蛋白质的程度出现乳酸脱氢酶（LDH-X）生理学意义乳酸(女性生殖道)

丙酮酸(提供能量)

精子代谢变化LDH-X部位：附睾成熟过程的一系列变化生理学意义精子的成熟(maturation)男性不育的常见原因包括精子活动力差或精子与卵子的相互作用障碍精子在附睾获得运动和受精等关键功能人、大鼠、小鼠的附睾分段附睾上皮的各种细胞类型CaputCorpusCaudaControlER

MTA1MTA1ER

MTA1和ER

在成年大鼠附睾的分布MTA1ER

胆固醇被转运入精子膜膜抗原：出现与消失附睾酸性环境膜负电荷增加，等电点降低膜结合的ATP酶活性下降凝集素(WGA,RCA)引起的精子凝集度下降二硫键形成：精子膜、核膜、线粒体膜结构更稳定顶体后区膜内蛋白颗粒(IMP)数量明显增多

PH-20:由整个头部移向头部后区精子成熟在附睾中的变化附睾管腔HCO3-的重吸收生理学意义

使精子获得前向运动能力掩盖精-卵相互作用的膜结构，该遮盖蛋白又称去能因子（DF），DF在精子获能中被移除稳定顶体区的膜结构，抑制过早的顶体反应精子表面覆盖带负电荷的蛋白质，不易产生凝集遮盖精子表面抗原，以免精子被识别和破坏调节精子膜胆固醇含量精子成熟精子获能(capacitation)部位：女性体内（子宫-输卵管）发现者：张民觉（家兔），Austin（大鼠）时间：1951年获能的本质：暴露精子表面识别装置去除DF

解除精子顶体反应抑制发生AR获能时间：人类5-6小时；小鼠

1小时；大鼠2-3小时；家兔5小时；美籍华人科学家张民觉与试管婴儿

张民觉Min-ChuehChang(1908～1991)

出生于山西省。1933年毕业于中国清华大学心理系

1938年赴英国剑桥大学主攻动物育种和人工授精

1941年获博士学位。1945年在美国乌斯特生物研究所工作

1961年兼任美国波士顿大学教授

1951年发现“精子获能”的生理现象，为哺乳类卵子体外受精成功奠定了理论基础，“张-奥原理”声名大噪，两人成为好友

1978年7月25日晚，英国女婴在曼彻斯特呱呱坠地这位女婴名叫路易斯·布朗张民觉博士成了新闻人物。采访他的电话接连不断，报纸以醒目的标题《张民觉的女儿》报道了试管婴儿诞生的经过张民觉一共发表了300篇余研究论文。他的研究不仅十分严谨，而且注重实用性

曾三次被提名为诺贝尔奖候选人，1989和1900年，他先后当选为第三世界科学院院士和美国科学院院士获得多个国际奖项：美国生殖学会的哈特曼奖（1970）；美国艺术与科学研究院的福兰斯奖（1975）；国际胚胎移植学会的先驱奖（1983）；国际体外受精及胚胎移植大会的奥尔索奖（1987）试管婴儿的过程与原理（1）

试管婴儿：体外受精-胚胎移植（IVF-ET）取出不孕症患者夫妇的卵母细胞和精子，使其在体外受精受精卵在体外培养至第2

3天，4

8细胞阶段时，移入子宫内胚胎植入，实现妊娠

体外受精-胚胎移植原理示意图试管婴儿的过程与原理（2）

单精子胞质内显微注射（ICSI），第2代“试管婴儿”

单个精子(精子细胞)注射入次级卵母细胞内，继而植入子宫适用于男性严重少精症、弱精症或阻塞性无精症体外受精-胚胎移植失败的患者没有顶体的精子，不运动的精子ICSI存在的问题：单精子胞质内显微注射示意图张民觉与试管婴儿路易斯·布朗1岁时的照片路易斯·布朗（右一）30岁生日前怀抱儿子与母亲（中）和为其父母做试管婴儿手术的罗伯特·爱德华医生（左）

获能后的变化

去能因子(decapacitationfactor,DF)的去除——

暴露精子表面特异受体（DF的产生部位：精囊腺）精子膜的变化：（1）糖蛋白：ConA受体和WGA受体向顶体后区移动（2）膜受体：四环素受体(富含钙的部位)减少,提示Ca2+代谢改变；

cAMP受体增加(子宫液cAMP含量高),精子活力增加（3）酶：精子腺苷酸环化酶活性增高，使cAMP的有效性和转换率增加（4）IMP：精子膜分布发生改变,出现无IMP区(没有或仅含极少量的胆固醇,且嵌入蛋白减少),膜脂的有序性下降,诱发脂肪酸链的扭曲,膜的流动性增大精子运动与代谢的变化:

（1）前向运动更加迅速有力，尾部摆动的幅度增大，有利于精子穿过透明带（2）氧耗量增加四倍精子免疫学性质的变化：

（1）精浆免疫抑制因子(IFs)——未获能精子具有免疫抑制作用（2）获能精子没有免疫抑制作用——获能的本质之一是去除免疫抑制作用精子获能（二）卵子的准备卵子达到一定的成熟度（排卵）：

否则精子不能穿入或不能形成雄原核2.卵子外围结构：透明带、放射冠、卵丘细胞

促进精子获能、调节精子成熟度、维持受精的种族特异性等

卵子停留在输卵管壶腹部：

等待受精卵泡发育和排卵后受精过程中的重要变化卵泡发育从胚胎时期开始，第5个月双侧卵巢约有700万个原始卵泡出生时大约有100万-200万个，至青春期只有4万个征集卵泡：从青春期开始，在FSH/LH的作用下，可使处于发育阶段15-20个卵泡加速生长优势卵泡的选择：每个月经周期，仅一个卵泡发育到排卵卵子第一次成熟分裂中止（前期）：时间长，为的是有更多数量的DNA用于RNA及蛋白质的合成，为受精作准备卵子第二次成熟分裂中止（排卵后）卵子第二次成熟分裂完成（受精后）卵子的准备二、受精的细胞与分子机理（一）顶体反应(Acrosomereaction,AR)（二）精子与卵子的结合（三）精子膜与卵子膜的融合（四）卵子的活化、两性原核的形成与融合受精过程中的主要事件顶体反应精-卵结合精-卵融合顶体反应顶体反应的过程精子膜不稳定性增加精子开始顶体反应去除抑制顶体反应因子精子膜与顶体内容物外溢点状融合顶体外膜顶体内膜暴露2.

顶体反应的适宜条件

Ca2+、温度、pH、渗透压3.与受精有关的主要顶体酶类

(1)透明质酸酶(分解卵丘细胞之间的透明质酸)(2)顶体蛋白酶(溶解透明带蛋白质，与精卵识别有关)(3)芳基硫酸酯酶A(4)酸性磷酸酶

(5)放射冠穿透酶

(6)-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶顶体反应顶体反应顶体反应前顶体反应中顶体反应ZP3蛋白引起精子顶体反应过程中激活主要的诸信号通路顶体反应精-卵结合与融合结合分为两步精子附于卵子表面(attachment)精子与透明带结合(binding)精-卵结合具有种族特异性精-卵结合与融合的关键分子

(1)精子：SP56:

凝集素样的蛋白质，与精子头部质膜相连。可以识别ZP3

中O-相连的寡糖的末端半乳糖基P95:

己糖磷酸激酶的酪氨酸-磷酸化形式，是精子膜的组成蛋白，位于精子的头部和尾部，有酪氨酸激酶的活性，该活性受ZP3的调节P

H-20:

精子膜和顶体膜的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，与蜜蜂毒液透明质酸高度同源并显示透明质酸活性

-1,4-半乳糖转移酶:与精子头部膜结合的酶，可以识别ZP3中

O-相连的寡糖末端乙酰葡萄糖胺残基低分子量的精子蛋白质：如精子黏附素(spermadhesins)和兔精子自身抗原(RSA)也涉及精-卵的结合Disintegrin(Fertilin,)：位于精子的赤道段，通过与卵子膜上的

3

1integrin受体结合（有CD9参与）,介导精-卵融合Izumo：位于精子顶体内膜，Izumo基因敲除后的雄鼠，完全失去生育能力（精-卵不发生融合）SPESP：位于精子赤道段，与精-卵融合有关NASP：位于精子的顶体周边区域，与男性生殖相关

(2)卵子：ZP1、

ZP2、

ZP3……ZP4?透明带（糖蛋白）——

精-卵结合

3

1integrin受体（精-卵融合）精卵结合精-卵膜融合精-卵膜融合赤道部受精过程

卵子的活化

（1）皮质颗粒释放（2）第二次减数分裂继续进行下去（3）第二次减数分裂的结果成熟卵子+第二极体卵子的活化、两性原核的形成与融合

雌原核的形成雄原核的形成

第二极体形成后精-卵融合后卵细胞的染色质散开精子核膜破裂染色质周围出现小囊泡精子核物质暴露于卵细胞胞质中融合成双层膜结构精子核解聚(染色体泡Karyomeres)

染色体泡融合以与雌原核形成过程类似的方式雌原核雄原核原核形成原核第二极体细胞核小鼠雌雄原核的形成与融合原核形成与融合原核形成与融合

生育-不育-节育：对立的统一

不育节育生育

基础研究-临床实践-药具开发

基础研究临床实践药具开发人口压力依然存在贫困人群不容忽视计划生育任重道远山区孩子求职大军UU与人精子共同抗原的研究医学研究实例

研究背景

1.

溶脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum,UU）

大小介于细菌与病毒之间，寄生于人类泌尿生殖道UU菌落

25-45m200UU菌体

50-300nm9600××★研究背景2.与生殖健康的关系

（1）性传播疾病：UU为非淋菌性尿道炎(NGU)的主要病因，我国NGU发病率占性传播疾病(STD)首位,且迅猛增多（2）不育症：占我国育龄夫妇4

%

10

%，感染是主要病因。

不育患者UU检出率明显升高

（3）生殖道感染性疾病：男性前列腺炎、睾丸炎、精囊炎等；女性盆腔炎、输卵管炎、宫颈炎、子宫内膜炎等

（4）妇幼健康：妊娠结局、胎儿发育、新生儿疾病

我国流行概况1.病原微生物：溶脲脲原体（UU）2.传播方式：性行为、母-婴垂直传播3.分布：全国所有省、直辖市和自治区(港、澳、台)4.发展趋势：呈迅猛上升势头研究成果——UU与男性不育1.UU吸附在精子表面：精子运动能力下降精子的破坏：磷脂酶，过氧化氢顶体的破坏Immuno-goldTEM68000

TEM7000

研究成果——UU与男性不育3.UU遮盖精-卵相互识别、作用的分子精-卵结合障碍，精子穿卵能力下降受精能力降低4.UU感染产生抗精子抗体：免疫不育机制？新的节育方法？UU与人精子共同抗原的研究

研究目的证明UU与人精子膜存在共同抗原发现UU与人精子膜的共同表位解释UU感染者产生AsAb的机理探索新的免疫避孕方法——节育疫苗

研究结果ELISA:

UU与人精子（膜）有交叉免疫反应SDS-PAGE：

UU与人精子（膜）多条相似电泳带：17.5–94KDWesternBlot:

25、50、61KD

（特异性免疫反应）UU精子膜抗人精子Ab61kDa50kDa25kDa筛选交叉反应抗原SDS

UU:Uu蛋白质；

S:人精子膜蛋白；M:mark1：免疫前兔血清2:兔抗人精子膜血清B.WesternblotAB证实纯化的25kDa蛋白质B:SDS

C:WesternblotatgaaaagaccattaattattggtgtaggtggacctgtaggagcaggtaaaacaatgctaMKRPLIIGVGGPVGAGKTMLatcgaaagattaacaagatacctttcaacaaaaggttatagtatggcagcaattactaatRYLSTKGYSMAAITNgatatttacactaaagaagatgctagaattttattaaatacttctgttttaccagctgatDIYTKEDARILLNTSVLPADcgtattgctggtgttgaaacaggaggatgtccacatacagcaattcgtgaagatgcttcaRIAGVETGGCPHMTAIREDAatgaactttgctgcaattgaagaaatgtgtgataaacaccctgatttacaattattatttSNFAAIEEMCDKHPDLQLLFttagaatctggtggggataatttatctgcaacatttagtccagatttagttgatttttcaLESGGDNLSATFSPDLVDFSatttatatcattgatgttgcacaaggagaaaaaattcctcgtaagggtggtcaaggaatgIYIIDVAQGEKIPRKGGQGMattaaatcagacttatttattattaataaagttgatttagctccttatgttggtgctaatIKSDLFIINKVDLAPYVGANgtagaagtaatgaaagccgatacattaaaatcacgtggtaataaagatttctttgtaacgVEVMKADTLKSRGNKDFFVTaatttaaaaacagatgaaggtttaaaatctgttgctgattgaattgaaaagcgtttgcaaNLKTDEGLKSVADWIEKRLQttagctttactagaagaataaLALLEEIERLT蛋白质测序共同抗原UreGIERLT21--25398-402UUNASPUreG和NASP之间共同表位五肽的分析人精子

搜寻UniProt/Swiss-Prot蛋白质数据库，发现在UreG(aa21-25)与人精子膜NASP(aa398-402)之间存在共同表位(IERLT)1234

重组UreG(

rUreG)片段分析(A):rUreG片段诱导进入pET-28a(+)表达载体，产生4个亚克隆；(B):SDS;(C)：采用rabbit-anti-hSMP血清(1:2000)进行WesternblothNASP(T1)370GQEAPVLPKDGAVNGPSVVGDQTPIEPQTSIERLTETKDGSGLEEKVRAKLVPSQEETKLSV431hNASP(T2)368GQEAPVLPKDGAVNGPSVVGDQTPIEPQTSIERLTETKDGSGLEEKVRAKLVPSQEETKLSV429mNASP355GQEITVIPNNGPVVGQSTVGDQTPSEPQTSAERLTETKDGSSVEE-VKAELVPEQEEAMLPV415人类NASP(hNASP)[包括transcript1(T1)和transcript2(T2)编码蛋白]和小鼠NASP(mNASP)的氨基酸序列A.体细胞型和睾丸型NASP基因结构比较（疫苗的安全性）AB

人NASP393-408合成肽段：hNASP与mNASP之间的共同表位非常相似,只是第一号的异亮氨酸被丙氨酸所取代,而且其抗原性不强,理化性质相似393408rUreG和NASP393-408精子表面的定位

a,d：经抗rUreG抗血清(1:50)孵育的精子涂片Bar=5µm

b,e：经NASP393-408抗血清(1:50)孵育的精子涂片

c,f：对照血清孵育的精子涂片

rUreG:重组UreG；

NASP393-408:人NASP393-408合成肽段人精子小鼠精子Anti-rUreGAnti-NASP393-408对照精子-卵子结合实验Anti-UreGPreimmuneSerum

精-卵结合与融合实验(invitro)

获能的小鼠精子与不同稀释度的对照组（单用佐剂）IgG、纯化的rUreGIgG(A)以及抗NASP393-408IgG(B)预孵育,再与卵子共孵育anti-rUreGanti-NASP393-408Groupanimalspupsborn(mean±SEM)

housedfor21-30dwithmale(n)housedfor150-180dwithmaleControlrUreGimmunizedhtNASP393-408immunized168.63±0.267.43±0.35161.63±1.31**2.54±0.26**

161.75±1.34**8.72±0.93rUreG或NASP393-408免疫后,对小鼠生育的影响(invivo)

有生育力的雌性BALB/c小鼠分别用纯化的rUreG和NASP393-408合成肽耦联KLH免疫,对照组用福氏佐剂加上KLH。三周后,计数每只交配动物平均产仔数

**

p<0.01(14/6/4)专利申请Uu与人精子膜蛋白之间存在交叉反应抗原是Uu感染引起AsAb升高、并且导致不育的主要原因NASP抗体在抑制生育中起作用，而且是可逆的从微生物探索免疫节育抗原是可行的结论这篇高质量的研究首次提供了Uu感染导致男性不育的明确依据。而且，本研究结果表明，可能开发一种免疫节育疫苗。最新研究进展Uu474蛋白和精子膜蛋白Izumo存在交叉反应抗原Izumo的Ig结构域抗体具有抗生育作用在该Ig结构域中通过鉴定出一个是B细胞表位的交叉反应抗原（ATLTK）Uu436蛋白和精子膜蛋白SPESP存在交叉反应抗原将SPESP分为三个片段，其中A片段抗体有抗生育作用在A片段中鉴定出一个是B细胞表位的交叉反应抗原（TGGFT）IzumoIzumo是精子特异的蛋白，定位于精子顶体内膜，只能在精子发生顶体反应后才能检测到Izumo基因敲除后的雄鼠，其精子形态和运动能力都正常，但是完全失去生育能力（精-卵不能发生融合）Izumo是精-卵融合的关键分子Izumo本实验室通过生物信息学技术搜索Swiss-Prot蛋白数据库，发现Uu474蛋白和Izumo存在交叉反应抗原为了确定Izumo蛋白具抗生育作用的主要位点，根据小鼠Izumo的结构域，将其分成3段进行克隆表达在Izumo的Ig结构域中通过生物信息学和Western-blot的方法鉴定出一个是B细胞表位的交叉反应抗原（ATLTK）经过小鼠的体内体外实验，发现Izumo的Ig结构域具有抗生育作用，可能用于构建免疫避孕疫苗用合成的交叉反应抗原肽（包含ATLTK）免疫小鼠，发现其也具有抗生育作用IzumoABCA