白组培技术研究进展

白组培技术研究进展

b.f.狼型是一种多年生草本植物，也被称为白及、连和草和甘根。分布在中国和韩国，分布在中国和韩国。它位于中国东部、华南、河南、陕西、四川、云南以及其他地方。白及块是中国传统的中药。《神农本草经》中有记载。在《中国药典》中，记载了具有益肺、肿胀、肌肉、止血、止血等功效。用于治疗肺损伤、伤口、伤口、溃疡、疼痛、唐菖蒲伤口、手脚撕裂等疾病。此外，白'的颜色也是一种非常鲜艳的景观植物。因此，市场对白'的需求非常高。由于市场需求的扩大，近年来中国大部分地区的野生白'非常采集和挖掘，野生自然资源急剧下降、灭绝。为了保护白'的野生资源，需要手动繁殖和种植白'。由于种子小，没有多少种子，自然条件下很难发芽和生长，也很难种植幼苗。传统的栽培主要依靠根系繁殖，但根系繁殖周期长，繁殖效率低，种植量大，难以满足许多栽培的需要。组织培养技术可以快速繁殖大量幼苗，比根系繁殖更快速、更高效。近年来，中国科学家开始探索白'组织繁殖技术，为白'栽培提供水源，实现人工栽培，取消对野生资源的依赖。本文总结了近年来中国白'组的培训和相关研究，为今后的研究提供了参考。1培训白鹿组的方法根据选用的外植体不同,白芨组织培养的途径主要分为2类.1.1种子萌发和组培白芨种子虽然没有胚乳,但郭顺星和徐锦堂的研究表明,白芨胚的薄壁细胞贮存大量的蛋白质、油脂和碳水化合物,可作为种子萌发的营养成分,因此白芨种子在保湿的情况下可以萌发,是兰科植物中种子易萌发的类型.故此,目前大部分白芨组织培养研究的外植体都选用种子,采用Bemard创立的非共生萌发法,将种子播撒在培养基上进行无菌萌发.种子萌发后所采用的组培程序则各有不同.有的作者采用“原球茎→诱导原球茎增殖→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序,增殖主要利用诱导原球茎增殖完成,继代培养也采用原球茎;有的作者采用“原球茎→诱导丛生芽增殖→诱导芽的分化及生根”的组织培养程序,继代培养使用丛生芽;有的则直接采用“原球茎→诱导芽的分化→诱导生根”的组织培养程序;还有的作者采用原球茎直接“生长分化→诱导生根”的程序.这些组培方法都能取得扩繁的效果,但扩繁效果有一定差别.白芨的蒴果中有大量的种子,并且蒴果的消毒较方便,污染率低.另一方面用种子作为外植体操作较容易,并且组培过程中萌发率高,培养的幼苗生长较为迅速,因此,种子作为外植体应用比较广泛,大部分的组培研究都选用种子.1.2白作为外植体的诱导植株植物的分生组织也可用来进行组织培养.1960年,Morel采用大花蕙兰的茎尖进行组织培养,成功地获得了无病毒植株.近年也有一些作者探索利用白芨的块茎、侧芽、茎尖或根作为外植体的组培体系.何俊蓉等用白芨新鲜块茎的顶芽、余朝秀等用茎尖及侧芽、石云平等用侧芽和块茎、韦卡娅等用块茎,以及田英翠和袁雄强用白芨的幼根,都获得了白芨的组培苗.组织培养的过程一般都是由诱导丛生芽和诱导生根2个步骤构成.韦卡娅等同时进行了2种组织培养途径的对比实验,结果表明利用幼嫩块茎作为外植体诱导丛生芽60d才有小芽形成,且分化效率不高;而用种子作为外植体,30d就开始萌动,60d小苗就分化完全.由于所需时间长、分化效率低,因此用块茎、侧芽等作为外植体的方法目前远不如种子萌发方法普遍.2种子萌发相关因素的基本过程和影响2.1种子的无菌播种2.1.1果皮萌发率张建霞、付志惠等对不同成熟度种子萌发的研究表明,胚从授粉到成熟一般需要4~5个月,随着白芨胚龄增大,胚成熟度不断增加,有胚率和萌发率逐渐提高,种子萌发时间逐渐变短.20周后采收的蒴果有胚率最高,萌发率为100%,萌发时间只需1周;3~4个月胚龄的种子萌发率也都比较高,萌发期较短,适宜作为组织培养种子,在野外则一般在每年的9~10月蒴果由淡黄到褐色成熟之际采集比较合适.若采集的白芨种子不能及时进行培养研究,也可用塑料袋密封保存于5℃的冰箱中.赵仁全等的研究表明5℃条件下对种子贮藏最为有利,贮藏60d后种子萌发率才开始缓慢下降,贮藏5个月时种子萌发率仍达50%左右,而冷冻和常温条件均不利于白芨鲜蒴果的保存.2.1.2种子处理和接种白芨蒴果的消毒过程比较简单,一般取未开裂的蒴果用洗衣粉或肥皂洗净,于超净工作台上用70%的乙醇浸泡30s,再用0.15%升汞浸泡8~10min,无菌水冲洗3~4遍后置于灭菌的吸水纸上,吸干水分待用.对于已开裂的果实可先用75%的乙醇灭菌后,取出种子,用白细布包裹,置于10%次氯酸钠中浸泡5~10min,取出再用无菌水冲洗3~4次,即可用于无菌播种[4,13,14,15,16,18,21].2.1.3种子萌发和前茎诱导在外植体消过毒以后即可将其接种到培养基中进行种子萌发.种子萌发过程中基本培养基、激素及添加剂都起到了重要的作用.(1)/2ms基本培养基MS或1/2MS,Knudsonc(KC)为白芨种子萌发中最常用的培养基.大部分研究者采用MS或1/2MS为基本培养基[9,11,12,14,15,16,18,21],有的采用Knudsonc(KC)为基本培养基,还有的采用花宝一号和花宝二号.总的来说,1/2MS培养基中种子的萌发率高而且生长正常,一般实验经常采用.而以花宝一号和蛋白胨为主要原料的PT培养基,成本较低,有利于白芨大规模生产时降低成本.(2)-ba对种子萌发的影响激素在种子的萌发过程中也起到了重要的作用,大量的实验表明NAA对种子的萌发有一定的促进作用,关于6-BA的作用存在一定的争议:袁宁等通过对比1/2MS基本培养基与1/2MS+1mg/L6-BA培养基,认为6-BA有助于种子的萌发,而张燕等通过对比1/2MS+1mg/LNAA与1/2MS+1mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+2.0g/LAC,1/2MS+1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+2.0g/LAC,认为6-BA不利于种子的萌发,由于后者的对比有AC的干扰,故关于6-BA对种子萌发的影响还有待于实验验证.(3)激素、添加剂对种子萌发的影响添加剂同样影响到种子的萌发,马铃薯泥和香蕉泥对种子萌发有较好的促进作用,但活性炭、番茄汁对种子的萌发则有一定的抑制作用.总结众多作者不同实验中激素、添加剂的影响,对种子萌发有益的培养基组成有以下2种:①1/2MS+10%椰子汁;②1/2MS+1.0mg/LNAA+50g/L马铃薯泥.种子萌发期间,环境条件控制在昼温20~25℃,夜温18~20℃,暗培养.(4)原球茎的增殖白芨萌发过程中,种子首先吸水膨胀,约5d后种胚细胞开始分裂,细胞数目增多,椭圆形胚体积明显增大,约14d后突破种皮萌发成原球茎,然后原球茎的顶端先产生叶原基,接着分化出幼叶,长成小苗.小苗继续培养,又能产生根原基,形成根系.一般组织培养过程中的萌发培养基应有利于原球茎的增殖而不利于原球茎分化,白芨种子在Knudsonc培养基中萌发时,原球茎容易直接分化为小苗,因此对利用原球茎增殖这一过程是不利的.2.2原球茎增殖期间培养基的选择由于白芨种子萌发时首先形成原球茎,有些研究者对原球茎进行诱导增殖,以达到扩繁的目的.在无菌条件下,将种子萌发形成的原球茎分割并接种于增殖培养基中,10d左右原球茎开始分化,形成新的原球茎前期,新形成的原球茎不经分割继续培养30d,有的形成丛生形的原球茎,有的形成芽和小植株.此期间培养条件为:温度(25±2)℃、光照8~10h/d、光强1500~2000lx,培养28d左右即可获得大量的增殖.原球茎分割可采用纵切法(将原球茎纵切为二)、横切法(将原球茎横切为二)和掰开法(将大丛原球茎顺势掰散成小丛或单个)3种分割方法.实验表明,掰开法最有利于原球茎的增殖,纵切法次之,横切法易导致原球茎褐变而死亡.原球茎增殖期间培养基的选择也是很重要的,基本培养基一般选取MS和ZW,有利于原球茎增殖和分化的培养基组合见表1.其中,当激素中6-BA的质量浓度为1.0mg/L,NAA的质量浓度为0.1mg/L时有利于白芨原球茎的增殖,而0.5mg/L的6-BA和0.1mg/L的IBA有利于白芨原球茎的分化.由于原球茎增殖时分割较难操作,也有很多研究者不进行原球茎的增殖而直接诱导丛生芽.2.3丛生芽诱导增殖培养基的优化利用丛生芽途径进行繁殖的增殖系数大,且获得的试管苗在遗传上较稳定,不易发生变异.将种子萌发或增殖得到的原球茎、不定芽或截取实生小苗茎尖接种至适宜的增殖培养基中,28d左右可获得大量的丛生芽.诱导丛生芽增殖的基本培养基中MS,PT,Kyoto效果要好,激素中6-BA和NAA对丛生芽的诱导都具有促进作用,但2,4-D则在很大程度上抑制丛生芽增殖.袁宁等通过进一步的正交试验研究了6-BA和NAA共同作用时对丛生芽诱导增殖的最优浓度,利用Duncan新复极差法检验结果表明,丛生芽诱导增殖培养基的最优组合为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L.2.4适于根的培养基配方当幼苗长到约2.5~3.5cm时可转入生根培养基中培养.生根培养基选取1/2MS作为基本培养基,同样生根过程中激素和添加剂也起到了重要的作用.有益于生根的培养基配方见表2.NAA有利于根的生长,且随其浓度的增加根的平均长度增加.香蕉泥、活性炭等添加剂也有增加根长的作用,而蛋白胨的添加则抑制了白芨的生根.田英翠等的实验表明番茄汁有利于根茎横向生长,而GA有利于根茎的伸长,两者结合则可以壮苗,总结各培养基的效果,1/2MS+NAA0.5mg/L+香蕉泥75g/L是比较理想的选择.2.5湿度的影响在白芨试管苗生根后长到3~5cm时可炼苗移栽.白芨试管苗的叶较薄,炼苗过程中极易脱水而使叶边缘焦枯,从而影响成活率,因此应保证在炼苗前期的空气湿度在80%~90%之间.一般的炼苗过程是将培养容器打开,于室内自然光照下放3d左右,然后取出小苗,用自来水冲净根上的培养基,移栽到经消毒的基质中,适度遮荫,保持一定的湿度.待组培移栽苗新叶展开和新根长出后,即可按常规管理.3作为外植体的基本培养过程和影响因素，如大坝和其他组织的影响3.1高水势梯度中侧芽和斑块的大量培养实验表明,新鲜白芨的茎尖、块茎、侧芽以及幼根也都可以作为白芨组培的外植体.田英翠等用幼根、何俊蓉等用块茎的顶芽、余朝秀等用茎尖及侧芽、石云平等用侧芽和块茎、韦卡娅等用块茎作为外植体进行白芨的组织培养.在实验中,以侧芽为外植体的培养效果较块茎好一些,主要因为侧芽的灭菌效果较好且恢复生长较快,但利用块茎培养可以使外植体的采集不受到季节的限制,即使在白芨的休眠期也可以培养,而侧芽一般选在3~5月份采集,能使培养过程中分化率较高而且受污染程度较小.总体上目前以块茎等为外植体的研究报道相对较少一些,主要由于侧芽和块茎的数量有限且培养较为困难.3.2侧芽和斑块的消毒处理以侧芽或块茎做为外植体需要严格的消毒,余朝秀等通过实验得出了该过程消毒的最佳方法,即首先用清水洗净侧芽和块茎上的污物,再用洗衣粉溶液浸泡20min,清水冲洗后转移到超净工作台上,用75%乙醇浸泡30s,再用0.2%升汞表面消毒,侧芽消毒8min,块茎消毒12min.经灭菌后的侧芽和块茎用无菌水冲洗5~6次,即可切取培养.3.3丛生芽的诱导利用侧芽或块茎,以及茎尖和根尖等为外植体时,组织培养的程序与种子萌发的过程有一定的差别,其中最大的差别是组织培养的程序不经过原球茎增殖而直接进行丛生芽诱导.何俊蓉、余朝秀、石云平等由组织诱导丛生芽,然后诱导生根,只需2个培养基即可.田英翠等的培养步骤则包括诱导原球茎、原球茎增殖、幼苗分化以及诱导生根3个步骤.韦卡娅则只用1个诱导培养基.3.4ba和naa,iaa,新的诱导根培养基的制备方法除田英翠和袁雄强采用ZW培养基外,其他作者大多采用MS培养基,有的在诱导生根时用1/2MS培养基.何俊蓉在诱导丛生芽的培养基中,添加BA和NAA,在诱导根的培养基中,则添加BA,NAA和IAA;石云平采用MS为基本培养基,生根采用1/2MS,附加不同浓度的BA和NAA.田英翠等在诱导原球茎中采用ZW+1.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+10%椰子汁+2g/LCH+30g/L蔗糖,效果良好,而在生根培养基中,添加了GA和番茄汁的效果好于不添加的,说明GA和番茄汁有明显的促进根系发育的作用.3.5椰糠混炭基质材料与种子萌发得到的苗相似,幼苗长到3~5cm时可以炼苗和移栽.余朝秀的研究表明移栽的基质选取碎砖、蕨根、碎炭、粗椰糠混合基质或黄土-炭渣-椰壳(2∶2∶1)、珍珠岩-泥炭土(1∶3),以及袁宁等的实验中应用的60%腐叶土+30%珍珠岩+10%素红土等都能使移栽的成活率达到90%以上.而移栽的季节尽量选在春季,气温逐渐回升有利试管苗适应自然环境,最宜移栽,如在冬季炼苗则必须加温.4白生物固质资源的筛选需要考虑到的其他白芨的组培快繁技术大大缩短了白芨的繁殖周期,很大程度上满足了生产的需要,近年来有关的研究更呈逐渐增多的趋势.在这些研究中,一般都讨论了培养基、激素及添加剂等,并分析了这些因素对组织快繁效率和效果的影响.总体来说定性的研究多,而对真正的产出率的考虑还不多.此外,目前各实验所用的白芨,均为就便取材的材料,没有经过很好的种质资源筛选.白芨要真正实现工厂化育苗和人工栽培,除需要在组织培养方