植物内生细菌的基因工程防治

植物内生细菌的基因工程防治

植物内部环境是一种微生物，可以在一生或一生的特定阶段进入植物组织，并不会导致植物明显变化。内生细菌普遍存在于植物体内,与寄主植物在长期进化过程中建立了和谐联合关系,是植物微生态系统中巨大而宝贵的资源库。自20世纪90年代起,植物内生细菌的研究已成为微生物学家关注的热点。首先,内生细菌具有丰富的种群多样性,对寄主植物具有内生固氮、促生、抗病虫害、杀线虫等多种作用[5,6,7,8,9,10,11,12];其次,内生细菌在植物体内占据稳定的生存空间,不易受植物外环境的影响,在植物体内独立地繁殖和传递,并与植物病原菌竞争相似的生态位,是具有生防潜力的微生物菌群;此外,国外已有许多报道称内生细菌能够降解环境中的污染物,具有生物修复能力;同时内生细菌可作为潜在的生防载体菌加以利用。植物内生细菌种类多、繁殖快、代谢产物丰富、易于培养,在化学农药引起的一系列环境污染的当下,植物内生细菌显然具有重要的应用前景。笔者就植物内生细菌的国内外研究动态及其在农林业病虫害生物防治上的应用潜力以及存在的问题进行阐述和讨论。1植物内生细菌植物内生细菌名称经历了近百年的发展,但内生细菌的概念至今尚未统一。1866年DeBary首先将生活在植物组织内的微生物与那些生长在植物表面的表生菌(epiphyte)相区别,提出了内生菌(endophyte)的概念,认为凡是在植物体内的微生物均为内生菌。1926年Perotti等在许多健康植物根部组织发现了细菌,并用“bacteriorrhiza”(菌根)一词对它们进行描述,改变了人们关于“植物体内无细菌”的认识。这一发现被确定为“植物组织内存在细菌”的起始点。此后大量研究进一步证实了“植物健康组织内存在内生细菌”的观点。1986年Carrol将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内而不引起明显病害症状的微生物。1992年Kloepper等认为,植物内生菌是指能够定殖于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内,并能与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物。1995年Wilson将内生菌的定义扩展为一生或一生中的某个阶段能进入活体植物组织内,并在植物组织内不引起明显组织变化的真菌或细菌。1997年Hallmann等将植物内生细菌重新定义为:从表面消毒后的植物组织中分离到的或从植物内部获得的细菌,但它们的存在并不引起植物的表观性状和功能的改变。随着植物内生细菌研究的不断深入,人们对内生细菌的概念也在逐渐完善,目前以Wilson提出的内生菌的概念被大多数研究者所支持和普遍采用。植物内生细菌的传统分离方法是研磨表面消毒后的植物组织,将匀浆液稀释涂布平板,然后进行分离和纯化。传统的内生细菌分离方法具有简便、易操作、费用低等优点,但该方法也存在一定的局限性。首先,由于部分内生细菌难以模拟其生长繁殖的真实条件而不能获得纯培养,导致非可培养细菌的种类和数量被忽视;其次,传统方法分离内生细菌时植物组织表面消毒方法以及消毒时间都会影响内生细菌种类和数量调查的准确性;再次,分离内生细菌时所选用的培养基以及所用抗生素对内生细菌的数量和种类也存在一定的影响;此外,传统的分离培养技术人为地改变了内生细菌本身的生境、微生物的群落结构以及内生细菌与寄主之间的相互作用,因此用传统方法研究植物内生细菌的种群结构及多样性时存在较大的局限性。很多情况下传统分类方法难以区分种内的相似或相近菌株,随着分子生物学技术的不断发展,通过对植物组织中细菌16SrDNA基因序列来鉴定植物组织中的内生细菌的种类,该方法不需要对内生细菌进行分离培养,直接以植物组织的基因组DNA为材料,减少了复杂的分离过程,并且其灵敏度和准确性远远高于传统分类方法,可全面地了解植物内生细菌多样性的真实水平,该方法主要包括扩增rDNA限制性分析(ARDRA),限制性片段长度多态性(RFLP),随机片段扩增多态性(AFLP),变性梯度凝胶电泳(DGGE),温度梯度凝胶电泳(TGGE)及构建16SrDNA克隆文库等。分子生物学方法为内生细菌种群多样性、动态分布及其与根际土壤微生物的关系等的研究提供了更有效的技术手段。Conn等对澳大利亚小麦内生细菌多样性的研究发现,与传统的分离培养法相比,用分子手段得到的内生细菌的多样性较为丰富。2不同氮素合成内生细菌在植物体中的定殖效率植物体是一个复杂的微生态系统,在这个系统中多种微生物与植物体形成营养和竞争的小生境。在长期的协同进化过程中,内生细菌之间、内生细菌与植物之间形成了一系列互利共生关系,这使得内生细菌能够长期稳定地定殖于植物体,并与植物体和谐共处。植物内生细菌同根际细菌一样,都受生物因子和非生物因子的限制,但植物内生细菌抵御生物和非生物胁迫的能力比根际细菌要强。Siciliano等研究发现,在污染地区对难降解物具有降解能力的细菌中,内生细菌所占比例高于根际细菌,暗示了内生细菌在这些难降解物的新陈代谢中发挥着重要作用。同时,许多内生细菌还参与土壤中磷元素的代谢,为植物提供有效磷素营养,促进植物生长,提高作物产量。Kuklinsky-Sobral等认为大豆内生细菌参与了磷的同化作用,表明内生细菌具有溶磷能力,从而能有效促进植物生长。内生细菌在植物体中的定殖效率是其生防能力的一个关键性因素,然而,在自然环境中内生细菌的定殖效率受到许多因素的影响。研究发现,植物内生细菌的定殖效率不仅与植物体本身有关,还与内生细菌自身的基因组及在植物体内定殖的先后次序有关。在接种早期,内生细菌的定殖效率因植物体不同而异;而到接种后期,内生细菌在不同植物体中的定殖效率则无明显差异。此外,Araujo等还发现,内生细菌在植物体内的定殖将抑制其他内生真菌的定殖,反之亦然。因此,在生物防治过程中,应当充分考虑到这些影响因素,尽可能地使内生细菌的定殖效率处于一个最佳状态,充分发挥其应有的生防作用。植物体中内生细菌的种群和数量呈动态分布,受植物生理机能的影响。内生细菌与寄主之间存在双向选择,即内生细菌的多样性和群落结构会随环境因子及寄主基因型的不同而发生改变;同时寄主植物也会根据环境的变化选择合适的内生细菌,来适应环境的选择压力。Fuentes-Ramírez等研究发现,与施低氮肥的甘蔗相比,施高氮肥的甘蔗中重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)的数量减少。这是由于施加氮肥后甘蔗的生理机能发生改变,蔗糖量下降,从而抑制了内生细菌的生长和繁殖。Tan等的研究表明,对水稻施加氮肥后,水稻的内生细菌种群结构随之发生急剧变化。同时,内生细菌的接种方式及植物体的健康状况对内生细菌在植物体内的成功定殖并发挥功能起着决定性作用。因此,在实验室内进行内生细菌的定殖研究时应避免选择生长状态不良的植株,并且要选用合适的接种方式,以期获得可靠的结果。Reiter等发现,与未被感染的马铃薯相比,被软腐病菌(Erwiniacarotovora)侵染后的马铃薯中内生细菌多样性偏高。这可能是由于在内生细菌体外定殖实验中,土壤固有细菌与内生细菌之间的竞争较小,因此与自然界中内生细菌的定殖能力相比,所得结果略微偏高。Afzal等对柴油污染地区的黑麦草进行内生细菌BurkholderiaphytofirmansPsJN接种试验,采取4种不同的接种方式,最终发现灌根接种能够使PsJN菌株实现最佳生防效果。3植物内生细菌内生细菌可长期稳定地定殖于植物体,通过自身产生的拮抗物质和酶类,与病原菌竞争营养物质和生态位,诱导寄主植物产生系统抗性及防卫信号来持续抑制病原菌的生长和入侵[7,49,50,51,52,53]。当前,内生细菌已被广泛应用于农作物病害的防治。如Gao等发现枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Em7是油菜茎腐病的有效生防因子,温室盆栽试验表明,菌株Em7对由核盘菌引起的油菜茎腐病的防治效果达到50%~70%。Aravind等将假单胞菌接种于黑胡椒干部和根部发现Pipercapsici的侵染率降低了90%;在根部接种绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)后P.capsici的侵染率降低60%。在根部接种藤黄短小杆菌(Curtobacteriumluteum)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)后土壤中线虫数量减少70%以上。这些内生细菌在防治病害的同时还对黑胡椒扦插苗的生长有促进作用。同时,内生细菌还可用于林木病害的防治。Ren等自杨树树干分离到1株对杨树溃疡病菌有较强抑制作用的内生细菌BurkholderiapyrrociniaJK-SH007,该菌株能够长期定殖于杨树体内,并对杨树的生长有一定的促进作用。B.subtilis对小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt))有较强抗性,温室灌根接种试验表明,将B.subtilis灌根接种于小麦根部后小麦全蚀病的发生率显著降低,并对小麦有一定的促生作用;野外试验表明,B.subtilis对小麦全蚀病的防治效果达55.3%。因此,在农业上可将B.subtilis用于防治小麦全蚀病的发生和危害。此外,内生细菌在果蔬保鲜和果蔬采摘后腐烂病害的防治上也发挥着一定作用。与植物病害的防治相比,内生细菌在害虫防治上的应用相对较少。Rajendran等在温室条件下测定了棉花内生细菌对美洲棉铃虫的防治效果。发现所分离的103株内生细菌中有2株芽孢杆菌(Bacillus)和1株荧光假单胞菌(P.fluorescens)对美洲棉铃虫的防治效果最为明显。将这3株内生细菌制成生物菌剂,喷施棉花的种子、叶片及根际土壤,结果显示美洲棉铃虫的发生率显著降低,因此可将这3株内生细菌作为生防菌来有效防治棉花虫害。同时,内生细菌可作为构建工程菌的理想载体,将外源固氮、抗病、杀虫等基因导入植物体中,增强植物的生长和抗逆能力。因此,对植物内生细菌的基因工程研究受到越来越多的关注。目前,国内外已经对内生细菌的基因工程改造开展了大量研究。相关研究表明,将Bt基因导入甘蔗、玉米、棉花、水稻等内生细菌中后,植物本身具备了显著的杀虫能力,并且改造后的内生细菌保持了固有的固氮、促生、抗病能力。黄玉杰等将枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因导入伯克氏菌B418,所得工程菌对大丽花轮枝胞、立枯丝核菌、麦根腐长蠕胞、禾谷丝核菌的抑菌效果显著提高,并保持了原有的固氮、解磷、解钾和促生作用,提高了菌株B418的生防能力。由此可见,基因改造后的内生细菌具有更强的生防能力,能够更好地应用于植物病虫害的生物防治。4内生细菌对石油衍生物的降解能力植物内生细菌具有净化有毒废弃物和环境污染物的能力,这种能力可能与生俱来,也可能后期由特定功能基因编码获得。Newman等发现内生细菌能增强植物对甲苯的耐受力以及抑制甲苯的挥发,表明内生细菌可以通过降解有毒物质来补救植物。因此,可将某些内生细菌开发为有毒物质降解剂来加以利用。此外,内生细菌还具有降解石油及其衍生物的能力。deOliveira等调查了沥青泥污染地区的植物内生细菌,测定了这些内生细菌降解石油及其衍生物的能力。结果发现6个实验菌株均具有一定的降解能力,但随降解时间不同,细菌的降解能力也随之变化,且降解能力与时间不存在一定的相关性,但多数成分在48~72h基本都能被降解,这一结果可能与石油衍生物组分的复杂程度有关。大量研究还发现,植物体内存在着抗各类重金属的内生细菌,内生细菌的存在增加了植物体内重金属的含量,提高了超积累植物富集重金属的能力,促进植物对土壤环境中重金属的去除。此外,植物内生细菌作为良好的外源基因载体已在植物修复中用于改善植物吸收、转运和固定重金属特性,有望快速提高超积累植物抗性,提高植物修复效率。5生防菌的筛选原则主要解决了生内生细菌几乎存在于所有植物体内,在植物体内长期稳定定殖并传导,不易受外界环境条件干扰,并能促进植物体的生长和发育、抵御病虫侵袭,是宝贵的天然生物资源。随着人们对自然环境保护意识的不断加强及现代农业逐步向生态型农业发展,将内生细菌替代化肥和农药来防治植物病、虫害,既保持了植物微生态系统的生物多样性,又实现了农业的可持续发展。植物内生细菌作为生防因子在实验室研究中取得了一定的成效,但将其释放到自然环境中尚需解决一些问题。首先,当前所研究的植物生防内生细菌大多是在实验室平板上筛选得到的,在筛选内生细菌时人们常以一种或少数几种病原菌作为筛选条件,导致所筛选的内生细菌生防能力单一,综合防治效果差,应用范围窄等问题。因此,在筛选生防菌时我们应当选取多种病原菌作为筛选目标,并将多种菌剂配合使用,来提高植物内生细菌的综合防治效果。其次,不同植物或不同组织中内生细菌的数量、种类和基因型不尽相同,寄主植物对某种特殊内生细菌基因型的敏感性会随环境的变化而改变,生态环境和植物体微生态系统中的许多因子都会影响内生细菌生防作用的稳定发挥,从而在一定程度上制约了内生细菌的生防效果。因此,利用内生细菌进行生物防治时不仅要考虑内生细菌的生物稳定性,还要考虑植物体自身的微生态环境及其所处的自然条件等因素。此外,目前内生细菌的研究主要集中在农业上,