教案7-1：染菌的防治

有机酸生产技术生物工程系谷氨酸发酵生产技术第七章染菌的防治第一节染菌的危害、途径及原因分析第二节噬菌体污染的防治第三节杂菌污染的防治主要内容一、染菌的危害二、染菌的异常现象三、染菌的途径四、染菌的原因分析第一节染菌的危害、途径及原因分析

一、染菌的危害

轻者影响产率，产物提取收率和产品质量；严重者造成“倒罐”，浪费大量的原材料，造成严重的经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。可能会出现以下一种或几种危害：①使培养基因杂菌的消耗而损失，造成生产能力下降；②杂菌合成一些新的代谢产物，或杂菌污染后改变了发酵液的某些理化性质，使发酵产物的提取和分离变得困难，造成产物收率降低或产品质量下降；一、染菌的危害

③杂菌代谢改变发酵液pH值，使发酵发生异常变化；④杂菌分解产物，使生产失败；⑤细菌发生噬菌体污染，细胞被裂解，导致整个发酵失败等。据报道，国外抗生素发酵染菌率为2%～5%，国内的抗生素发酵，如青霉素发酵染菌率为2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%～2%。

一、染菌的危害

氨基酸发酵中，染菌的危害程度往往与污染时间、污染杂菌种类以及污染程度有关，必须综合这些因素进行衡量。1、不同发酵时期染菌对发酵的影响种子培养期染菌：培养基营养丰富，容易染菌，而且种子染菌对发酵危害较大，应严格控制种子污染。注意控制种子质量，严防种子污染。发酵前期染菌：较容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧，严重抑制生产菌的生长繁殖，最终导致产物的积累大大减少，甚至造成发酵失败。早发现，快处理。发酵中期染菌：

危害极大，不但影响生产菌的继续生长，还会严重干扰生产菌的产物合成代谢，减少产物的生成。而且由于营养成分大量消耗，发酵产物正在大量积累，一般挽救处理困难，危害性很大。故在实际生产中应做到早发现快处理。发酵后期染菌：发酵后期产物积累较多，营养接近耗尽，此时染菌影响相对小些，一般可继续发酵；若污染严重，可采取提前放罐来减少损失。2、污染杂菌种类的影响（1）污染噬菌体

噬菌体的感染力强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。

氨基酸生产菌多为细菌，发酵前期污染噬菌体，发酵无法进行，重新灭菌处理后的培养基黏度大，提取困难。一般发酵后期不会感染噬菌体。（2）污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。污染芽孢杆菌耐热，不易杀死。

3、污染程度的危害染菌程度越大，意味着进入发酵罐的杂菌数量越多，对发酵生产的危害越大。染菌程度的危害性必须结合染菌时间、杂菌种类、发酵周期等来综合分析。T4噬菌体细菌二、染菌的异常现象1、种子培养异常菌体生长缓慢；菌丝结团；代谢不正常；显微镜观察菌种有异常。2、发酵过程异常：菌体生长差；pH异常；溶氧异常；泡沫过多；菌体浓度异常三、染菌的途径

发酵过程中造成发酵染菌的原因很多，各种染菌途径一般归纳为四个方面：

①菌种或一级种子不纯；②生产设备和工艺管路存在隐患；③生产操作不当；④操作环境条件差；1、菌种或一级种子不纯（1）菌株本身不纯：主要指保藏菌种和斜面菌种不纯。获取的菌种不纯，而又未能及时、有效的进行分离纯化，是发酵染菌最大的隐患。（2）一级种子不纯：氨基酸发酵中主要指摇瓶种子不纯。检查方法：镜检法、划线法、稀释培养法；2、生产设备与工艺管路存在隐患（1）空气除菌设备的隐患：空气除菌流程；空气过滤设备的设计；过滤介质的选用、装填及灭菌；这些方面都必须使除菌效率达到要求。2、生产设备与工艺管路存在隐患（2）培养基灭菌设备的隐患：培养基灭菌设备包括二级种子培养基、发酵培养基及所有补加料的连消设备与实消设备。2、生产设备与工艺管路存在隐患（3）培养设备的隐患：包括种子罐、发酵罐。发酵罐设计或安装不合理，存在空消、实消的死角；2、生产设备与工艺管路存在隐患（4）管道与管件的隐患：管路设计、安装不合理，存在管路灭菌的死角；法兰、阀门连接不紧密等。3、生产操作不当

（1）灭菌操作不当：培养基的灭菌；设备的灭菌；管路的灭菌

①培养基的灭菌：种子培养基、发酵培养基以及所需补加的物料需要灭菌。操作：灭菌温度、灭菌时间达不到要求；有些进气排气阀门没有按要求打开通达空气，造成死角。其他操作。（1）灭菌操作不当：

②设备的灭菌：过滤器与过滤介质的灭菌、培养基连消设备、种子罐、发酵罐、贮料罐等的空消。操作：灭菌温度、灭菌时间达不到要求；有些进气排气阀门没有按要求打开通达空气，造成死角。（1）灭菌操作不当：③管路的灭菌：所有无菌要求的管道。如无菌空气进入发酵罐的管道、发酵罐的接种管道、消泡剂的流加管道、葡萄糖液流加管道等，输送无菌物料前必须进行充分灭菌。（2）菌种移接操作不当：菌种移接操作不当主要表现在：一级种子接入种子罐时，离开火焰操作，或种子罐进入无压状态；种子罐接入发酵罐时，发酵罐处于无压状态等。（3）培养过程操作不当培养过程操作不当主要表现在：培养、发酵过程中，因突然停电使空气压缩机停止供气，没有及时关闭种子罐、发酵罐的进出口阀门，使罐压跌为零压货罐内醪液倒流到过滤器内；没有及时控制泡沫，引起逃液；补料后，管道内处于无压状态并残留物料，而罐体阀门关闭不紧密等。4、操作环境条件差

如不注意加强操作环境的卫生管理，溅撒出来的醪液没有及时清理干净，给予杂菌和噬菌体滋生的机会等三、染菌的原因分析

总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。总染菌率%=三、染菌的原因分析

染菌原因：种子；无菌空气、设备渗漏；灭菌不彻底；操作不当；管理不善等。1、染菌时间早期：种、气、设备、灭菌不彻底、操作不当；后期：补料不当、渗漏。三、染菌的原因分析

2、染菌种类耐热芽孢杆菌：灭菌不彻底；球菌或无芽孢杆菌：种、渗漏；浅绿色杂菌：冷水管渗漏；霉菌：灭菌不彻底或操作问题；3、染菌幅度各个或数个发酵罐感染相同杂菌：空气系统；个别罐连续感染杂菌：设备问题；第二节污染噬菌体的防治据报道：谷氨酸发酵噬菌体感染率为1%～2%。第二节污染噬菌体的防治主要内容：一、噬菌体污染的主要症状二、噬菌体的防治一、噬菌体污染的主要症状

染噬菌体表现为：OD值：发酵液光密度急剧下降。发酵液性质：泡沫增多、粘度增大、气味发臭碳源和氮源：消耗速率减慢甚至停滞。O2的消耗速率减慢甚至停滞；排气中CO2含量反常，迅速下降。镜检：菌体减少，缺少八字排列，发圆、发胖，革兰氏染色发现红色碎片，严重时出现拉丝或网状等。pH值：升高；平板检查有噬菌体。一、噬菌体污染的主要症状

目前我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌体，均属蝌蚪形。（二）噬菌体的检测方法①单层平板法②双层平板法③液体培养检查法④平板交叉划线法⑤载玻片快速法⑥增殖检查法⑦快速检测法⑧小剂量剌激检查法噬菌斑