医学分子生物学-上课用-12.基因诊断

2023/10/91第十二章基因诊断

Chapter12GeneDiagnosis

2023/10/92第一节基因诊断基础第二节遗传病的基因诊断第三节传染病的基因诊断第四节肿瘤的基因诊断第五节基因诊断在法医学上的应用

本章内容提要2023/10/93基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。YuetWaiKan1936～

第一节基因诊断的技术和方法

2023/10/94一、基因诊断的概念、特点及临床意义基因诊断：就是用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA或者蛋白质。

2023/10/95诊断依据(遗传物质改变)：1.DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；2.基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。2023/10/96基因诊断的特点：高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性2023/10/97二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Westernblot）免疫组织化学诊断2023/10/98（一）核酸分子杂交

指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。2023/10/99核酸分子杂交流程

待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针2023/10/910

提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。1.Southern印迹杂交2023/10/911RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。2.Northern印迹杂交2023/10/9123.斑点杂交（dotblotting）

将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。2023/10/9134.反向斑点杂交

先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。2023/10/914

寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸

(allelespecificoligonucleotide,ASO）2023/10/915ASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因2023/10/9165.原位分子杂交荧光原位杂交

(fluorescenceinsituhybridization,FISH）2023/10/917荧光原位杂交（FISH）2023/10/918（二）聚合酶链式反应

(polymerasechainreaction,PCR）模板引物dNTPMg2+

TaqDNA聚合酶变性延伸退火2023/10/919基因诊断中常用的PCR衍生技术:RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASOAS-PCRPCR-SSCPPCR-RFLP2023/10/9201.RT-PCR2023/10/9212.荧光定量PCR荧光标记引物2023/10/9223.多重PCR

多重PCR示意图A：普通PCR；B：多重PCR2023/10/9234.PCR-ASOASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因2023/10/9245.AS-PCR（allelespecificPCR）

等位基因特异PCR：根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物.

2023/10/925（三）单链构象多态性分析(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)

DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。2023/10/926PCR-SSCP分析原理2023/10/927正常人纯合突变杂合突变+PCR-SSCP分析

－2023/10/928

（四）限制性片段长度多态性分析

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。2023/10/929ABCDEFGGAATTCCTTAAGF－＋EcoRⅠ限制性内切酶位点的变化EBGC+DA－＋DEFBGCA2023/10/930GAATTCCTTAAG基因组DNA的E.coRⅠ酶切电泳图谱2023/10/931PCR-RFLP

设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。2023/10/932（五）DNA序列测定（DNAsequencing）2023/10/933DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)2023/10/934左侧：正常；右侧：突变序列分析用于基因诊断2023/10/935（六）生物芯片（biochip）基因芯片（genechip）蛋白质芯片（proteinchip）基因芯片杂交流程示意图2023/10/936基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法基本原理核酸分子杂交错配时杂交信号减弱或消失PCR变异引起扩增产物不同SSCP突变引起核酸二级结构改变RFLP基因变异改变酶切图谱DNA测序序列比对寻找差异生物芯片多元杂交寻找信号差异2023/10/937三、基因诊断技术路线与方法直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析2023/10/938（一）直接诊断途径必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系;被检基因正常分子结构已被确定;被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知.2023/10/9395/——5/—3/3/—RFLP点突变的检测

（1）有限制性内切酶位点改变40

-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测

M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；2：βA/βA；3：βA/βT；4：βT/βT注：由于54bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到PCR-RFLP分析

——

-珠蛋白生成障碍性贫血症2023/10/941斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序5ˊ——5ˊ—3ˊ3ˊ—（2）无限制性内切酶位点改变2023/10/942

在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等.

2.基因重排的检测核酸分子杂交与PCR.43α-基因不同程度缺失引起不同类型的α-地贫α1α2正常基本正常αααα+轻度贫血α+α+轻度贫血αα0高度贫血α+α0HbBart’s综合征α0α02023/10/944BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe

-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血2023/10/945

-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断aa/aaaa/a-aa/--a-/a-a-/----/--14kb10kb正常缺1缺2缺2缺3缺42023/10/9463.基因表达异常的检测mRNA的定量或长度分析：RT-PCR、Northern印迹杂交、定量RT-PCR等。蛋白质变化：WesternBlot.2023/10/947（二）间接诊断途径1.采用原因：(1)致病基因未知或基因结构不确定(2)致病突变机理不清(3)致病位点不便检测间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记。2023/10/948

2.遗传标记

DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。

2023/10/949三代遗传标记：

RFLPVNTR;STRSNP2023/10/9507.6kb13kb患者正常(1)RFLP标记的连锁分析——镰状红细胞性贫血病(HBS)的间接基因诊断HpaⅠ7.6kb13kbSouthern印迹杂交NHPN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针2023/10/951重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。串联重复序列散在分布于染色体上。重复单位为6～25bp，称为小卫星DNA。

重复单位为2～6bp，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。（2）串联重复序列长度多态性分析2023/10/952串联重复序列长度多态性分析串联重复序列两侧含有一些核酸限制性内切酶的酶切位点，切割后产生不同长度的DNA片段。串联重复序列两侧序列是保守的，可设计特定引物进行PCR，PCR产物长度不同。2023/10/953

第二节遗传病的基因诊断一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症二、血友病（Hemophilia）甲型血友病三、脆性X综合征2023/10/954正常（N）的ASO探针：

5´-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3´突变（M）的ASO探针：

5´-ACTCCTGTGGAGAAGTCTGC-3´1.镰状细胞贫血病的ASO杂交法检测一、血红蛋白病

（一）镰状细胞贫血病2023/10/955斑点杂交结果，N：正常；M：突变N-ASOM-ASO正常突变突变

纯合子杂合子纯合子2023/10/9565´3´正常基因1.15kb(CCTGAGG)×5´3´突变基因1.35kb(CCTGTGG)MstⅡ酶切位点（CCTNAGG）2.镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析2023/10/9570.2kb1.15kb1.35kb正常人携带者患者镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析2023/10/9583.镰状细胞贫血病的的PCR-RFLP分析

正常人的扩增产物经MstⅡ消化可生成54bp和56bp两个片段（1），而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp（2），杂合子可见三条带（3）2023/10/9591.PCR-RFLP分析

-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测

M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于54bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症2023/10/960

-珠蛋白生成障碍性贫血症的反相斑点杂交分析2.反相斑点杂交2023/10/961二、血友病（Hemophilia）甲型血友病是由于血浆凝血因子VⅢ（FVⅢ）缺陷造成。甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。2023/10/9621.FVⅢ基因倒位的DNA印迹分析

将基因组DNA用NcoI，DraI或BclI等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21.5kb、14kb和16kb三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14kb三种类型；Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5kb三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。

2023/10/9632.FVⅢ基因突变的检测（1）依赖于FVⅢ基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析（2）RFLP连锁分析（3）VNTR分析（4）短串联重复序列（STR）的连锁分析64三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（FMR1）5ˊ非翻译区遗传不稳定