地沟油中辣椒碱类化合物的液相色谱-串联质谱法检测

地沟油中辣椒碱类化合物的液相色谱-串联质谱法检测

“地沟油”一般指各种颓废的优质食用油。主要包括厨房垃圾，以及由动物皮、肉和内脏经过加工和精制的剩余油。因其来源不同、精炼加工程度不同,不仅食用油中亚油酸、亚麻酸等人体必需的脂肪酸、植物甾醇、生育酚等油脂伴随物的含量大幅降低,营养价值显著降低,而且还残留数量不等的重金属、真菌毒素、油脂氧化物等有毒、有害成分,长期或大量食用对人体健康极为有害。导致食用油中掺兑“地沟油”的现象在国内长期存在的原因,除了暴利驱使外,缺乏有效的检测技术也是重要原因。目前,对“地沟油”的鉴别检验方法已开展了大量的探索性研究工作,取得了一定的成绩,研究者开发、建立了以胆固醇及脂肪酸组成含量分析、电导率检测、外来污染物的检测(十二烷基苯磺酸钠、黄曲霉毒素)等检测“地沟油”的方法。但现有的各种餐厨废油脂检测方法存在特征指标专一性不强,或检测灵敏度不高,或检测准确性不高的问题;导致所建立的方法仅能在一定范围内适用于特定类型的餐厨废油脂的检测判定。辣椒中的辣味成分主要是辣椒碱,利用色谱、核磁共振等方法分析其化学组分后发现天然辣椒碱是由14种辣椒素同系物组成,其中辣椒素约占46%~77%,二氢辣椒素约占21%~40%,两者占90%以上。在各种食用香味调料中,丁香酚是其香味的主要成分之一。作为基本五味,在一日三餐的菜肴中都会或多或少地加入辣味和香味调味品。因此辣椒碱类物质和丁香酚广泛地存在于回收的“地沟油”中。据知情者介绍,社会上早已经形成了一个从收购到加工再到销售“一条龙”式的“地沟油”生产、销售链条。他们一般先将收集的餐厨废油脂(水、渣、油混合物)加热、脱渣,制成粗毛油;再通过加热和脱色(用活性炭、白土等),制成脱色油;脱色油或再经过高温真空脱臭,制成脱臭油。粗毛油以及经不同程度精炼加工生产的脱色油和脱臭油都是二次油(reusedoils)。由于使用有机溶剂进行化学萃取蒸馏提纯会大大增加加工成本,所以“地沟油”的精炼加工操作均为物理过程,从而使沸点高、易溶于有机溶剂的辣椒素和丁香酚在加工过程中难以去除,存留于二次油中,故本实验选择上述物质作为判定“地沟油”的检测指标。本文应用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),在多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)模式下,建立了测定油样中辣椒碱类化合物(包括辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素)及丁香酚(结构式见图1)含量的方法。该方法具有较高的定性准确性和灵敏度,可以以此判定食用油样品是否掺兑了“地沟油”。1实验部分1.1水质、数据处理美国ABI公司API2000液相色谱-串联四极杆质谱联用仪;岛津LC-20A型高效液相色谱仪;美国Beckman公司AllegraX-22R型冷冻离心机;美国Millipore公司Direct-Q3型纯水机;梅特勒公司(上海)AE240电子天平(十万分之一)。数据处理采用Analyst1.4.1分析软件(ABSciex)。辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒碱和丁香酚标准品由SIGMA公司提供;LC分析所用甲醇为色谱纯级,其他试剂均为分析纯级。1.2单标准储备液的制备分别精确称取辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素和丁香酚标准品10.0mg于10mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,得1.0g/L辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素和丁香酚单标准储备液。用甲醇稀释单标准储备液配制分别含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0μg/L辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素和1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L丁香酚的混合标准工作液。1.3加标油溶液配制分别用市售优质食用油30mL制成含辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素1.0μg/L、丁香酚100μg/L的加标油溶液。在上述加标油溶液中加入有机溶剂10mL,振荡10min,冷冻离心后分离有机层,用氮气吹干后,用甲醇溶解、定容,待LC-MS/MS分析。1.4流动相梯度冲洗色谱柱:SUPELCOSILABZ+PlusdC18柱(150mm×4.6mm,5μm,Sigma-Aldrich公司);检测辣椒碱类化合物所用流动相:甲醇(A)和0.1%甲酸水(B);检测丁香酚所用流动相:甲醇(A)和水(B)。流动相梯度洗脱程序:0~3min,20%A~70%A;3~6min,70%A;6~7min,70%A~90%A;7~12min,90%A;12~13min,90%A~20%A;13~23min,20%A(其中前12min完成对目标化合物的分析,13~23min完成色谱柱的冲洗及下次分析前的柱平衡)。流速:0.5mL/min;进样量:20μL。1.5质谱测定方式采用电喷雾离子源(ESI),在正、负离子电离模式下选用MRM扫描方式进行质谱测定;雾化气流量:15L/min;气帘气流量:12L/min;辅助加热气:氮气,流量8L/min;加热温度:500℃;喷雾电压:5000V;其他质谱条件见表1。2结果与讨论2.1萃取溶剂的选择大部分“地沟油”样品的黏度大,成分复杂,因此选用液-液萃取方法对油样品中的辣椒碱类化合物及丁香酚进行萃取较为合适。以正己烷、四氢呋喃为萃取溶剂,它们易与油样品发生混溶;选用甲醇、乙醇、甲醇-四氢呋喃(1∶1,v/v)混合液为萃取溶剂,经适当的振荡后,采用冷冻离心的方式能够较好地实现萃取液与油样品的分离。通过测定油样中添加标准品的回收率考察不同萃取溶剂的提取效果,发现甲醇对目标物的加标回收率最高。故实验中选择以甲醇作萃取溶剂对样品进行液-液萃取。2.2lcms方法的建立2.2.1色谱条件的确定分别采用不同的流动相体系考察样品的分离效果,以保留时间长短、色谱峰的重现性等性能指标确定最后的色谱条件。辣椒碱类化合物具有较高的极性,检测时采用甲醇和0.1%甲酸水流动相体系的分离效果较好;检测丁香酚时采用甲醇和水流动相体系的分离效果较好。通过试验确定了1.4节的流动相体系及梯度洗脱程序。考察了不同色谱柱对辣椒碱类化合物和丁香酚的分离效果。SUPELCOSILABZ+PlusdC18柱(150mm×4.6mm,5μm)的分离效果优于WatersAtlantisColumndC18柱(100mm×3.9mm,3μm)、WatersAtlantisColumndC18柱(150mm×3.9mm,5μm)和WatersAtlantisColumnT3柱(150mm×2.1mm,3μm)。2.2.2准分子离子峰[m+h]+的质谱特征实测得到辣椒碱类化合物的[M+H]+(辣椒素为m/z306.4,二氢辣椒素为m/z308.4,合成辣椒素为m/z294.0)和丁香酚的[M-H]-(m/z162.9)。一般来说,对具有酚类结构的化合物常采用负离子电离模式,但辣椒碱类化合物结构中还具有酰胺基团,在正离子电离模式下更易形成准分子离子峰[M+H]+。辣椒碱类化合物具有相似的分子结构,进一步裂解也得到相似的裂解产物,尤其是m/z137的碎片离子峰,其为C-N键断裂后形成的香草基部分,是辣椒碱类化合物的特征碎片离子峰。在辣椒碱类化合物的质谱分析中均检测到此离子碎片峰的存在,该离子碎片峰在测定中作为定量离子。辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素分子在失去m/z137的特征离子碎片后,得到不同的子离子碎片(见表1)。由于辣椒碱类化合物具有相似的分子结构,因此诸如碰撞能量(CE)等其他测定条件也相似。采用负离子电离模式检测丁香酚,在碰撞能量较低时亦能得到准分子离子峰[M-H]-。进一步裂解时其分子结构中香草基部分的甲氧基C-N键发生断裂,形成稳定的子离子碎片峰m/z148,将其作为定量离子。2.3标准曲线及关键因素在优化的LC-MS/MS条件下测定系列浓度的标准溶液,以信噪比(S/N)≥3确定方法的检出限(LOD),得到辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素及丁香酚的LOD分别为0.02、0.03、0.03和0.6μg/L。由于所建立的方法对辣椒碱类化合物具有较高的灵敏度,而对丁香酚的灵敏度较低,且检测辣椒碱类化合物和丁香酚需要采用不同的流动相系统、不同的电离模式,故采用两次进样分别检测的方式进行测定。在实际的“地沟油”检测中,以辣椒碱类化合物作为地沟油检测的主要依据,丁香酚作为参考。由表2可见在一定的质量浓度范围内,辣椒碱类化合物及丁香酚均呈良好的线性关系。图2为添加目标物标准品油样的MRM谱图。2.4回收率、精密度取辣椒碱类化合物及丁香酚的标准液和市售优质食用油,分别配成0.1、0.5、1.0μg/L的加标油溶液,每个水平加标油溶液各取3份,由3个不同人员进行测定,每个样品每人重复测定5次,得到的回收率和同一人员、不同人员间测定的精密度见表3。2.5实际检测结果采用本文建立的方法对5份不同品牌的市售优质食用油进行检测,在各检材中均未检出辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素和丁香酚。说明该上述方法的特异性良好。在卫生部举行的“地沟油”检验方法考评中,此方法经过多轮盲样验证考核,无一例误检为假阳性,“地沟油”阳性结果检出率超过80%,在所有检测方法中排名靠前。目前,该方