木霉对植物病原菌的拮抗作用

木霉对植物病原菌的拮抗作用

由于化学农药的严重公害，防治病虫害越来越受到重视，抗虫抗生素在植物疾病预防和控制中的应用越来越受到重视。木霉具有广阔的适应性、抗生性多样性、寄生虫广谱性和对环境的适应性。随着植物疾病的预防应用的蓬勃发展，木霉制剂在国外已经出版。例如，美国的通史布局赛（哈茨特22株细菌和以色列的tichodex（哈茨特19株细菌）和以色列的tricho3（哈茨特19株细菌）。在中国，木霉可用于控制各种作物的土传病，并取得了良好的预防效果。此外，木霉对土壤中原生动物细菌的抑制也是可持续的，具有良好的抗逆性，可以达到良好的病虫害防治效果，显著减少农药的使用。作者试图确定具有五种主要植物疾病的优势品种，并通过分离和细菌栽培、对抗性和室内栽培的实验来确定木霉植株的生防作用。1材料和方法1.1病原菌培养和利用病原菌:辣椒炭疽菌(Collectotrichumcapsici)、花生立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、白术白绢病菌(Sclerotiumrofsii)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani),由湖南省植物保护研究所提供.水稻恶苗病菌(Fusariummoniliforme)由湖南农业大学植病实验室提供.所有病原菌均保存于PDA培养基上,备用.供试番茄品种为白果强丰,武汉旺旺种苗生产.1.2方法1.2.1分生孢子梗丛束观察从湖南省浏阳、望城、长沙、宁乡各地的柑橘、葡萄、烟草、水稻、棉花和白菜等作物根围采集土壤.取样时拨开表土(约5cm深),每土样约取20g(同地区同种作物取样点至少相距500m以上).菌株分离采用稀释平板法和土壤平板法,把每样品中不同类型的菌落挑取到PDA培养基上纯化、备用.按文成敬的方法,将待鉴定的菌株接种于PDA平板上,置25℃下培养.在菌落产生孢子梗丛束而又远没有变为深绿以前,挑取分生孢子梗丛束制片,观察分出孢子梗形态;培养大约2周后,挑取分生孢子制片,观察孢子大小和形态并鉴定分离的木霉菌株种类.1.2.2木霉菌生长法检测3种主要病原菌对正合膜的抗菌材料的抗菌材料的抗菌材料的抗菌材料对3种木霉菌的生长和抗性采用对峙培养法,测定所分离的木霉菌株对5种病原菌的拮抗活性.分别挑取新鲜培养的5种病原菌菌丝块(直径约5mm)放在PDA培养基平板一侧的中间,同时在相对一侧的中间放置同样大小的木霉菌丝块,两者相距2cm.设未置木霉菌的病原菌固体培养为对照,每处理重复3次,25℃恒温培养,逐日观察菌落的生长和木霉菌的抑制作用,连续观察7～10d.待对照菌丝长满培养皿时测量处理病原菌菌落半径,拮抗系数分级参照徐同等的方法.将得到的对3种以上病原菌都有拮抗活性的木霉菌,进行拮抗能力比较,筛选出优势菌株,经鉴定为哈茨木霉(T.harzianum).1.2.3制备病原菌菌种用无菌水将25℃恒温培养8～10d的哈茨木霉孢子配制成1×108,1×107,1×106,1×105和1×104cfu/mL的分生孢子悬浮液,分别吸取各孢子悬浮液1mL注入灭菌培养皿中,再加入9mL冷却至45℃左右的PDA培养基,轻轻摇动使之混匀,制成平板(孢子最终为1×107,1×106,1×105,1×104和1×103cfu/mL),然后分别挑取病原菌菌块移植到平板中央,每处理3次重复,以无菌水取代菌株孢子悬浮液作为对照.经恒温培养3d后测量病原菌菌落直径,并比较不同浓度孢子悬浮液对5种病原菌的抑菌率.1.2.4番茄苗种处理从苗床感病的番茄苗上分离、纯化得到供试立枯丝核菌.置于PDA固体培养基上,于25℃下培养,直至其形成菌核.将番茄籽撒于装有经灭菌的菜园土壤的木盒中,待其长到3～4叶时选取长势较一致的健苗移至装有经灭菌的栽培土(为柑橘园土与沙土的混和物)的小盆中,每盆移入40株番茄苗作为一个处理.待番茄长到8～9叶时,将番茄立枯病菌的菌丝块和菌核撒于番茄盆土中,使其充分感染立枯病菌.在番茄健苗接种立枯丝核菌的同时,将哈茨木霉菌株孢子悬浮液(108cfu/mL)分别按1∶5,1∶15,1∶30,1∶60,1∶100的比例稀释,并以清水为对照,共设6个处理,每处理40株苗,每组处理设3个重复,对每处理每日各喷洒对应浓度孢子悬浮液50mL,放置玻璃温室内培养15～20d,观察记载发病情况.2结果与分析2.1土样木霉菌种类的多样性在27份土样中,有20份土样分离出了木霉菌,经分离纯化后获得28个木霉菌株,经鉴定共有8种木霉菌:哈茨木霉(T.harzianum)、拟康氏木霉(T.paeuaokoning)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、桔绿木霉(T.citrinoviride)、黄绿木霉(T.aureoviride)、康氏木霉(T.koningii)、绿色木霉(T.viride)和钩状木霉(T.hamatum),其中以哈茨木霉、拟康氏木霉为优势种群,分离频率分别为25.0%和17.9%.不同土样间木霉菌种类数量有差异,如从长沙的葡萄土样中分离得到5个菌株,而从宁乡的白菜土样中仅分离得到2个菌株.此外,同一作物不同地理区域根围土壤中分离得到的真菌种类的数量也有差别,如浏阳2份柑橘土样中分离到2个菌株,而长沙2份柑橘土样仅分离到1个菌株.这可能与地理位置、气候和采样季节有关.据已有的研究,不同种类木霉有不同的最适生长温度,其分布有明显的地域性,并随季节而变化,哈茨木霉和拟康氏木霉有较高的最适生长温度,往往在较为温暖的地区出现,因此分离得到的菌株多.2.2抗菌材料的筛选将分离纯化获得的28个木霉菌株(编号为1～28)对5种供试病原菌的拮抗活性按菌系分级所得结果见表1.由表1可看出,所得到的28株木霉菌株的抑菌活性和抑菌谱存在较大的差异,对峙法测定结果表明,26号菌株(即为筛选出的拮抗性强的菌株,经鉴定为哈茨木霉T.harzianum)对5种致病真菌均有强烈的拮抗作用,且拮抗活性均在2级以上;4号菌株仅对1种病原菌有拮抗作用,而11号菌株虽对3种病原菌有拮抗作用,但其拮抗活性未有超过2级的.此外,同一种木霉菌对不同病原菌的拮抗活性也存在差异,如18号菌株对立枯病菌拮抗活性为1级,对纹枯菌、镰刀菌的拮抗活性为3级.试验结果还表明,供试木霉菌拮抗作用的表现不是产生抑菌圈,而是使病菌菌丝生长受到抑制,木霉菌生长旺盛,产生了大量短绒状气生菌丝和分生孢子丛,可直接在病原菌菌落上生长,并逐渐将病原菌消解,因此表现出了较强的竞争生长能力.2.3哈茨木霉门氏菌回复突变试验见表1不同哈茨木霉孢子浓度对病原菌抑菌效果,可以从病原菌菌落在不同稀释度的木霉孢子平板中的生长直径看出,其测定结果见表2.由表2可见,在不同稀释度的哈茨木霉孢子平板中,病原菌菌落生长直径均小于对照,随着哈茨木霉孢子浓度的增高其生长直径逐渐减少,说明病原菌生长受到抑制,其抑制程度随木霉孢子浓度的降低而减弱.木霉孢子悬浮液基本能抑制5种病原菌的生长,根据不同木霉孢子稀释度与病原菌菌落直径扩展速率(菌落是逐步增长还是成倍增长)可作为有效抑制浓度的依据.试验结果表明,哈茨木霉孢子对立枯丝核菌、纹枯菌、镰刀菌和白绢菌抑制的有效浓度为105～107cfu/mL,对炭疽菌和镰刀菌的有效抑制浓度为106～107cfu/mL.2.4哈茨木霉对田间病害的防治作用通过温室盆栽试验表明,喷洒了哈茨木霉孢子悬浮液的处理中,番茄苗期发病率均低于对照.在喷洒高浓度(稀释比1∶5,1∶15)哈茨木霉孢子悬浮液的处理中,平均发病率最低,对番茄苗期立枯病的防效可达到80%以上,能有效防治该病害,即使在稀释了60倍后,对该病的防效仍有60%以上.随着哈茨木霉孢子悬浮液浓度的降低,其防病效果也逐渐减弱.说明哈茨木霉菌对该病害具有很好的防治作用,有望制成对土传病害具良好防治作用的生物制剂.在本试验中还发现,经木霉菌处理的番茄植株在一个月后均比对照植株高1/3左右,表明木霉菌孢子悬浮液可能