棉花立枯病木霉菌的药剂防治试验

棉花立枯病木霉菌的药剂防治试验

木霉菌具有广阔的光谱、广泛的适应性和多机制性，一直是植物疾病防控的重要对象。木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制,如抗菌素的杀菌作用,重寄生作用,溶菌作用,诱导抗病性和竞争作用。木霉菌产生十分复杂的几丁质酶和葡聚糖苷酶,破坏植物病原真菌的细胞壁,如从哈茨木霉菌中提纯了的一个β-1,3-葡聚糖酶,能阻止B.cierea分生孢子萌发,芽孢管延长并裂解其细胞壁;而在重复寄生过程中几丁质酶发挥着重要作用。平板抗菌活性、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶容易标准化操作,而且是木霉菌防治土传真菌病害的重要作用机制,因此,研究木霉菌株的几丁质酶和葡聚糖酶活性与高效生防木霉菌的筛选之间的关系,对于筛选出高效生防木霉菌株有重要的指导价值。1材料和方法1.1木霉素1.1.1绿色木菌T1-1,T2-1,LR,LTR-2,LTR-2K,Q1,Q2,2(2),Ag2-1,X41。1.1.2实行x.2.2%h3.2%h3,4,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,T1,T4,T5,T6,T7,T8,T9,T10,T11,TC,Sxb,Y32,X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10,X11,X12,X13,X14,X15,X17,X18,X19,X20,X22,X23,X24,X25,X26,X28,X29,X30,X32,X33,X34,X36,X37,X38,X39,X40。1.1.3康福木菌TK,TK7a,其中TK7a由澳大利亚联邦科学院水土所(CSIROLand&Water)MaartenRyder博士提供。1.1.4绿色木材菌Tg21,TL31,浙江大学楼兵干博士提供,对郁金香球茎致病。1.2菌落抑制率的测定将纯化好的木霉菌与棉花立枯病菌在PDA平板上培养3d,用打孔器挖取直径为0.5cm的菌块,分别置于PDA平板同一直径的两端,相距6cm。进行对峙培养,以只接种立枯病菌块的平皿为对照,重复三次。置于培养箱中28℃培养。4d之内连续观察记录,并于对峙第72h量取菌落半径,取三次平均值,按下式计算抑制率。抑制率=(对照立枯病菌菌落半径—与木霉菌对峙的立枯病菌菌落半径)/对照立枯病菌菌落半径×100%。同时显微观察木霉菌与立枯病菌在菌落交叉处的相互作用情况。1.3透光率的测定将不同木霉菌2×107个木霉孢子分别接种于培养基(KNO310g,KH2PO45g,MgSO4·7H202.5g,FeCl32mg,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1%,蔗糖5g,几丁质胶体5g,加水至1000mL,pH=6.0)中,28℃150r/m振荡培养3d。培养物于8000g离心10min,所得上清用玻璃纤维滤纸过滤,用0.45μm的超滤膜过滤除菌。所得液体为样品几丁质酶液。将0.5mL样品几丁质酶液和0.5mL几丁质胶体(1%,悬浮于50mmol磷酸钾缓冲液和0.02%NaN3中,pH=6.7)混合,25℃培育24h。以100℃灭活15min的样品几丁质酶液作对照。将培育好的混合物用5mL蒸馏水稀释,在510nm测透光率,以胶状几丁质悬液透光率增加来计算酶活,重复三次,取平均值。规定透光率增加10%的酶量为1个酶活性单位(U)。酶活性(U)=10×(处理液透光率—对照液透光率)/对照液透光率式中:10代表由透光率增加10%酶活力单位增加1U的换算系数。1.4粗酶液及葡萄糖的制备将木霉接种于培养基(0.5g葡萄糖,6.7g酵母浸出粉,4.0g茯苓粉,1g(NH4)2HPO4,0.2gKCl,0.2gMgSO4·7H2O,加水补足至1000mL)中,28℃150r/m振荡培养72h。将培养物于8000g离心10min,所得上清用玻璃纤维滤纸过滤,用0.45μm的超滤膜过滤除菌,所得液体为样品粗酶液。酶活性测定底物为昆布多糖(Sigma)。用砷钼酸法测定酶反应液中的还原糖含量(Arsenomolybdatereagent),1min内产生1μmol葡萄糖的酶量定为1个酶单位。按下式计算酶活性单位(U/mL):1U=葡萄糖浓度×106/(180.16×15)式中:葡萄糖浓度:mg/mL;106:当量,μg;180.16:葡萄糖分子量;15:反应时间,min。1.5盐碱地棉花立枯病病情调查参照以前方法,选择以下38个菌株参加棉花立枯病盆栽防治试验:T4,X9,X36,T11,Ag2-1,X30,T6,2(2),X11,X25,Q1,T5,LTR-2K,Q2,LTR-2,Sxb,T1,X23,Y32,X13,TC,LR,X26,TK7a,X24,X14,Tg21,X28,T8,X22,T10,X5,X3,TL31,X18,X20,X8,X6。棉花立枯病病情调查分级标准:0:无病;1:茎基部有小病斑,占茎围的1/4以下;2:茎基部的病斑较大,约占茎围的1/4～1/2;3:茎基部的病斑占茎围的1/2以上,但尚未破坏整个茎围;4:茎基部的病斑占据全部茎围,植株死亡。病情指数=(各病级×各级株数)×100/最高病级×总调查株数防效%=(对照病情指数—处理病情指数)×100/对照病情指数。1.6糖酶活性及三角转换前后的平景观性验算各因素与木霉菌株防病能力的相关性分析,以几丁质酶活性,β-1,3-葡聚糖酶活性以及三角转换后的平皿抑制率为自变量,以三角转换后的木霉菌株防治效果为因变量,计算相关系数,并进行显著性测验。菌株间在抑制率、防治效果、几丁质酶活性和葡聚糖酶活性方面的差异采用最小显著差异法(LSD)进行测验。2结果与分析2.1棉立枯病菌的抑制率及生物测定对峙培养72h后,木霉菌对棉花立枯病菌的平板抑制率在0.59以上的有22株,占所调查菌株数约1/3;除T8,X38,T6,X3,X2以外,其它56株木霉菌拮抗抑菌率均大于0.5,占所调查菌株的93%。显著性差异测验表明,菌株间对棉花立枯病菌的抑制率有显著差异,根据抑制率大小顺序,可将60个菌株划分为5个组,1组抑制率为0.612～0.665,2组为0.584～0.604,3组为0.541～0.581,4组为0.506～0.533,5组为0.479～0.497。在对峙培养的48h挑取两个菌落相交叉的菌丝在显微镜下观察,发现木霉菌丝对棉立枯菌丝有明显重复寄生现象,形态上表现为缠绕、紧贴和穿透病菌菌丝,最终造成病菌菌丝的解体。对棉花立枯病菌丝有明显重寄生现象的菌株有Sxb,2(2),T2-1,LTR-2,LR,Tk,T1-1,Ag2-1,Tk7a,T4,X19,X27,X32,X33,X38,X40共计16株,占所有菌株的26.2%。2.2木霉菌对几丁质酶的活性几丁质酶活性在7U以上的菌株有TC,T8,T1-1,X2,X3,X1,T1,2(2),X25,Sxb,X36,X20,T9,X5,Tg21,T2等16株;酶活性在5-7U之间的木霉菌株有X11,X19,X8,X38,Y32,X9,T4,X32,T7,X33,Ag2-1,Q,TK7a,X7等14株,其它木霉菌株几丁质酶活性均在5U以下,其中菌株TK,X34,X37的酶活性低于2U,X30没有检测到几丁质酶活性。显著性差异测验表明,菌株的几丁质酶活性有显著差异,根据酶活性大小顺序,可将60个菌株划分为4个组,1组酶活性为8.6-14.8U,2组为6.0-8.4U,3组为3.9-5.6U,4组为0.1-3.6U。2.3其它菌株酶活性比较共有2(2),X33,TL31,TK,X9,X20,X41,X30,X14,X7,X28,X3,TC,LRT-2K,X18等15株木霉菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性高于1000U,其中2(2)的酶活性明显高于其它菌株,高达4662U。酶活性在500-1000U之间的菌株有LR,X4,LTR-2,X23,Q2,X19,X1,X10,Q1,T2-1,TK7a,X22等12株;其它菌株酶活性均低于500U,其中菌株X25,X7,X11,T1,T4,Sxb的酶活性为0。显著性差异测验表明,菌株的β-1,3-葡聚糖酶活性有显著差异,根据酶活性大小顺序,可将60个菌株划分为7个组,1组为1个菌株,活性为4662.0U,2组为2849.0U,3组为1176.6-1646.5U,4组为629.0-1128.5U,5组为229.4-536.5U,6组为125.8-185.0U,7组为0-55.5U。2.4治效果在盆栽条件下,38株木霉菌对棉花立枯病都有防治效果,其中菌株T4,T11,X9,X36和Ag2-1的防治效果最好,达到了75%以上。显著性差异测验表明,菌株间对棉花立枯病菌的防治效果有显著差异,根据防治效果的高低顺序,可将38个菌株划分为6个组,1组为75.0-85.1%,2组为58.3-73.3%,3组为46.7-55.0%,4组为30.0-43.3%,5组为21.7-28.3%,6组为13.3-15.0%。2.5木霉菌对棉花枯病的防治机制经过计算,木霉菌对棉花立枯病的防治效果与平皿对峙抑制率,几丁质酶及葡聚糖酶活性的相关系数分别为0.097,0.052,0.012;检验概率分别0.564,0.775,0.941,均远远大于假设显著水平0.05,可见木霉菌对棉花枯病的防治机制与以上三个单独因素无相关性。成对分析平板抑菌能力分别与几丁质酶和葡聚糖酶、几丁质酶与葡聚糖酶之间的相关程度,同样发现它们之间没有显著相关性,表明这3个性状是相互独立的,没有数量上的连锁关系。3木霉菌的防治效果缺少简便易行而又可靠的筛选方法是目前植病生防木霉菌筛选工作的一个主要问题,影响了木霉菌的开发。当前筛选一个新的抗土传真菌病害的木霉菌株并用于工业化生产,一般要经过以下几个过程。首先,到病害田的土壤中,在病株根际采集土样。用选择培养基进行筛选并进行形态学初步鉴定。然后以典型的土传真菌病害为指示菌,作平皿对峙培养。观察是否有抑菌效果,对于效果好的木霉菌株,又要进行严格的盆栽试验进一步观察,最后进行田间防治效果评价等程序。但从实验室向大田阶段的过渡往往遭到失败,其中生态学障碍是主要原因,木霉菌在自然条件下难以有效防治棉花枯萎病,它的孢子等繁殖体不能在土壤中大量存活;如何克服土壤的抑菌作用,是解决木霉菌防治效果低下和不稳定的关键。由于以上各种原因,要筛选一个真正在大田有效的生防木霉菌是十分困难的,往往徒劳无功,而且费时费力。在菌种筛选方面,杨合同发展了一种筛选木霉菌生防菌株的新方法,利用木霉菌分生孢子与棉花凝集素的凝集反应可以快速可靠地考察木霉菌株的根际定殖能力,而利用木霉菌分生孢子与枯萎病菌凝集素的凝集反应可以快速可靠地考察木霉菌株的重复寄生能力和潜在的生物防治能力,然而发现在立枯病和黄萎病系统中,凝集反应与寄生能力和防治效果间的关系不存在。木霉菌的防治效果与平板抑制能力、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶产生能力在菌株之间有显著差别,体现了木霉菌的多样性;病害防治效果与抑菌能力和酶活性之间没有数量上的相关性,说明根据这些单个性状的表现筛选木霉菌生物防治菌是不可靠的,尽管这些性状是重要的作用机制。另外,平板抑菌能力、几丁质酶及葡聚糖酶间也没有显