烟夜蛾基因18srdna序列克隆及序列分析

烟夜蛾基因18srdna序列克隆及序列分析

糖核糖体（ribosmalka）是糖核的主要成分，包括一个大亚甲基和一个小亚甲基。其中真核生物核糖体的小亚基RNA由染色体基因编码,称为18SrDNA基因(18SrRNA),它在蛋白质合成中具有重要的功能,常被作为蛋白质定量分析的内参基因(Suzukietal.,2000)。在漫长的生物进化过程中,由于18SrDNA基因的二级结构基本格局变化较少,核苷酸替换率较低,是至今发现的DNA序列中最为保守的一类。因此,18SrDNA基因是研究生命起源和早期生物进化、高级分类阶元系统发育关系的主要分子标记,被认为是最有希望解决早期动物进化形式的工具(吴平等,2000)。研究表明18SrDNA基因具有丰富的生物学信息。应用于昆虫高级阶元系统分类后,不仅符合传统分类的特征,也能解决一些传统分类不能解决的问题,如用18SrDNA基因研究昆虫各目间的关系,证明了鞘翅目不是一个单系,它与脉翅目、广翅目和蛇蛉目为姐妹群(Carmeanetal.,1992;Pashleyetal.,1993;Whitingetal.,1997);在进化关系上捻翅目与弹尾目比较接近(王瑛等,1999),鳞翅目、鞘翅目、双翅目和膜翅目比较接近(魏国清等,2006)。在目以下分类阶元的研究方面,目前主要集中在鞘翅目、半翅目、同翅目、直翅目和膜翅目,利用部分18SrDNA基因片断探讨亚目或总科、科的系统发育关系(Caterinoetal.,2002;Marvaldi,2002;Bourgoin,1997;Martinetal.,1993;李红梅等,2006;刘殿锋等,2005;柳娟娟,2007),但研究结果受所选取基因片断影响较大。近年来,随着昆虫分子生物学研究的不断深入,一些昆虫的18SrDNA全序列不断被克隆出来,为此,本文在克隆得到烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guenée)18SrDNA全序列的基础上,选取几种已知18SrDNA全序列的蛾类昆虫,通过构建全序列和不同序列片段的系统发育树,分析了利用18SrDNA构建发育树的最适片段和方法,探讨了在低级分类阶元中应用的可能性,期望为蛾类昆虫分子系统学研究提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验昆虫烟夜蛾采自河南农业大学科教园区烟田,在室内用人工饲料饲养,光照条件16L∶8D,温度26±1℃,相对湿度75%±2%。1.1.2试剂和生化试剂基因组提取试剂盒UniversalGenomicDNAExtractionKit、DL2000Marker和rTaq酶购自TaKaRa公司,DNA凝胶回收试剂盒购自天为时代公司,其他生化试剂均为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1dna提取基因组提取按TaKaRa公司生产的UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0方法提取。1.2.2dna的合成参考GenBank上已登录的棉铃虫和家蚕的18SrDNA基因序列,用Primer5.0设计特异性引物,覆盖蛾类昆虫的18SrDNA全部序列,序列如下:18SP1:5′-TCCCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3′(正向引物)18SP2:5′-GCAAATGCTTTCGCTGATGTTC-3′(反向引物)18SP3:5′-TAATGATCCTTCCGCAGGTTC-3′(反向引物)18SP4:5′-GCCTGAGAAACGGCTACCACATC-3′(正向引物)以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2.3rtaq0.2orta2o反应PCR反应过程如下:以50ng烟夜蛾基因组DNA为模板,10×Buffer2.5μL,dNTP2μL,正向引物和反向引物各为2μL,rTaq0.2μL,补充ddH2O至总体积25μL,反应在SENSOQUESTLABCYCLER公司生产的PCR扩增仪上进行。反应程序为:94℃1min,56℃1min,72℃2min,35个循环,最后延伸10min(用18SP1和18SP2引物对、18SP3和18SP4引物对时延伸时间1.5min,用18SP1和18SP3引物对时延伸时间2min),4℃保存。1.2.4回复突变体的构建PCR反应结束后,经琼脂糖电泳检测后,在紫光灯下切下目的条带,使用天为时代公司生产的DNA片段凝胶回收试剂盒纯化产物。将回收产物与TaKaRa公司生产的PMD-19载体进行连接(回收产物3μL、PMD-19载体1μL、Solution1.5μL,ddH2O补齐10μL),之后将连接产物转化入JM109感受态细胞中,在含有LB(Amp80μg/mL,IPTG40μg/mL,X-gal40μg/mL)固体培养基中37℃培养12h,进行蓝白斑筛选,随机挑选阳性重组子,扩大培养并提取质粒DNA,质粒DNA用PCR检测,选取正确的克隆送TaKaRa公司测序。1.3序列分析2结果与分析2.1ssr-pcr扩增以烟夜蛾基因组DNA为模板,利用18SP1和18SP2、18SP3和18SP4、18SP1和18SP3共3对引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果(图1)。从图1可以看出,产物大小分别为1kb、1.5kb和1.9kb左右,与预期大小一致,分别命名为Hass18SrDNA-1、Hass18SrDNA-2和Hass18SrDNA。将纯化的扩增片段与PMD-19载体连接,转化大肠杆菌JM109,无菌条件下均匀涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB平板上,37℃培养箱内过夜培养。挑选白斑转入含有Amp的LB培养基中扩大培养,用PCR方法鉴定出阳性克隆并进行测序。序列测定结果表明,利用引物对18SP1和18SP2、18SP3和18SP4、18SP1和18SP3进行扩增,分别得到了1021bp、1492bp和1904bp的序列。其中Hass18SrDNA-1和Hass18SrDNA-2序列有609bp的重叠(图2),进行序列拼接后与HassHass18SrDNA与已登录的其他蛾类昆虫的18SrDNA具有较高的一致性,因此,该基因为烟夜蛾18SrDNA的全长序列(已在GenBank中登记,登录号为EU057177)。2.2烟夜蛛同源性和缺失区的组成及序列比对用GeneDoc软件分析8种蛾类18SrDNA全序列的同源性,用MEGA4.0软件计算这些基因两两间的遗传距离,结果见表2。可以看出,已报道8种蛾类18SrDNA全序列的同源性达92%以上,遗传距离介于0.003～0.037之间。其中同科蛾类间的同源性相对较高,遗传距离较近,如夜蛾科的烟夜蛾和棉铃虫的同源性达到99%,遗传距离仅0.003;天蚕蛾科的柞蚕和蓖麻蚕的同源性为95%,鹿纹天蚕蛾则例外,与两种夜蛾的遗传距离更近。利用GeneDoc软件对8种蛾类的18SrDNA进行多序列比对,根据结果得出烟夜蛾的同源区和多变区分布图(图3)。可以看出,烟夜蛾与其他蛾类共有4段同源区,而多变区则分布在序列的中部。在这些蛾类18SrDNA全序列中最保守的两段序列Part1长度为352bp,Part2为长度503bp,分别相当于烟夜蛾18SrDNA的第306bp至653bp和第922bp至1424bp区域。两段序列中的多变区长度为269bp,相当于烟夜蛾18SrDNA基因的第654bp至921bp区域。2.3家蚕、斑蛛、鹿纹天蚕类型的聚合分析利用MEGA4.0软件,采用邻位连接法(NJ)和最大简约法(MP);利用Phylip3.67软件,采用最大似然法(ML)(经全局重排,自展重复数为1000)分别构建8种蛾类18SrDNA全序列、保守区Part1+Part2序列和保守区Part1与Part2间多变区序列的系统发育树,得到图4～6。从图4可以看出,在用NJ法构建的18SrDNA全序列系统发育树中,烟夜蛾与棉铃虫首先聚在一起,其次与鹿纹天蚕蛾共聚一支;家蚕与斑蛾聚在一支上,并与大蜡螟共聚一支,这两支共同聚集在一支上,天蚕蛾科中的3种蛾类距离较远,与传统分类不相符合。在用MP法构建的系统发育树中,棉铃虫与烟夜蛾共聚一支,柞蚕与蓖麻蚕聚在一支,两者共聚后与鹿纹天蚕蛾聚在一起,接着分别与蜡螟、家蚕和斑蛾共聚,与传统分类比较符合。在用ML法构建的发育树中,家蚕和斑蛾聚在一起,然后与蜡螟共聚一支;柞蚕与蓖麻蚕聚在一支,然后与家蚕一支共聚,棉铃虫与烟夜蛾共聚一支,而鹿纹天蚕蛾独自一支,此结果与用MP法构建的发育树结果接近,不同的是ML法中,鹿纹天蚕蛾独立存在,与天蚕蛾科的距离较远,更接近于夜蛾科的两种昆虫。从图5可以看出,在用NJ法构建的保守区系统发育树中,烟夜蛾与柞蚕聚在一起,棉铃虫与家蚕聚在一起,然后共聚在一支上,而鹿纹天蚕蛾、蓖麻蚕与蜡螟共聚一起,天蚕蛾科中3种蛾类相距较远,夜蛾科两种昆虫也未聚在一起,与传统分类明显不符。在用MP法和ML法构建的系统发育树中,棉铃虫与斑蛾首先聚在一起,其他与NJ法结果相近,也与传统分类明显不符。从图6可以看出,用NJ法和MP法构建的多变区系统发育树结果相似,烟夜蛾与棉铃虫共同聚在一支上,天蚕蛾科中的柞蚕与蓖麻蚕聚在一支,蜡螟、家蚕和斑蛾共聚在另一支上,而鹿纹天蚕蛾却聚在了夜蛾科的一支上,与传统分类比较符合。而用ML法构建的发育树却显示了不同的结果,烟夜蛾与鹿纹天蚕蛾首先相聚,然后与棉铃虫聚在一支;蜡螟、家蚕与鹿纹天蚕蛾共聚一支;柞蚕与蓖麻蚕分别位于不同的分支,与传统分类差异较大。3形态分类方法在18srdna全序列系统发育树的应用真核生物18SrDNA全序列长度一般为1800bp左右,本研究的8种蛾类18SrDNA序列全长为1849～1907bp,基本在这一范围之内。根据MEGA4.1软件的统计,8种蛾类18SrDNA全序列中碱基A、T、C和G的平均含量分别为25.3%、25.5%、22.3%和26.9%,表明碱基组成基本上无偏异。因此,可以认为本研究构建的系统发育树没有受到碱基组成偏异的影响或影响甚微。随着分子生物学技术的不断发展,依据核酸、蛋白质序列信息研究分子进化(molecularevolution)成为生命科学中最引人注目的领域之一。其中在昆虫分子系统学研究方面,目前多通过选择合适的基因序列,利用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建系统发育树来分析物种的进化(许丽等,2007;王伟芹和刘志琦,2007),至于这3种方法的优劣尚无公论(NeiandKumar,2000)。一般认为,若有合适模型使用ML法效果较好;近缘序列一般使用MP法;而远缘序列一般使用NJ法或ML法。本研究采用最大简约法(MP)构建的蛾类18SrDNA全序列系统发育树或基于保守区Part1与Part2间的多变区序列构建的系统发育树与传统分类系统比较接近,唯一例外的是天蚕蛾科的3个种,同源性分析与遗传距离分析同样支持这一结果。一般认为柞蚕和蓖麻蚕属于Saturniinae亚科,而鹿纹天蚕蛾属于Hemileucinae亚科,但也有认为Hemileucinae亚科不应归属于天蚕蛾科,而应独立为Hemileucidae科,本研究结果支持后一种观点。通过分析蛾类昆虫的系统分化可以发现,斑蛾科分化较早,然后蚕蛾科和蜡螟科分别分化出来,天蚕蛾科介于蚕蛾科与夜蛾科之间。虽然许多人认为最大似然法(ML)在原理上优于前两种方法,是最接近进化关系的算法,但从本文的结果来看,ML法始终未能显示出与传统分类结果相似的特征,仅在该基因的全长序列分析中显示了接近的结果。上述结果已经表明,三种方法相比,在构建蛾类18SrDNA全序列系统发育树时,采用MP法的构建结果更加符合形态分类系统;ML法则显示出与MP法较为近似的结果;在构建多变区序列系统发育树时,用NJ法和MP法结果差异不大。因此,对于分类地位不明确的蛾类,可以克隆其18SrDNA基因全序列或多变区基因序列进行分析。近年来,利用18SrDNA基因进行科以下分类阶元的研究逐渐受到关注。Marvaldi等(2002)将18SrDNA序列数据和形态数据相结合,研究了鞘翅目象甲总科各科之间的系统发育,得到的树的拓扑结构很好地解决了各科的单系性和他们之间的关系;Ribera等(2002)用18SrDNA证明了鞘翅目肉食亚目水生肉食类的单系性;Ohnishi等(2003)研究了膜翅目蚁科7个亚科的系统发育关系;Sha等(2006)研究了姬