利拉鲁肽对糖尿病大鼠h

利拉鲁肽对糖尿病大鼠h

糖尿病肾内源性一氧化氮基因（enos）-一氧化氮（no）的轴向连接是dn的原因之一。eNOS是内皮细胞产生NO的关键酶,糖尿病肾脏中该酶活性降低,肾小球血管内皮细胞NO生成能力严重受损,但具体机制未明。GLP-1类似物如利拉鲁肽,对糖尿病血管并发症有保护作用。GLP-1受体(GLP-1R)在肾小球血管内皮细胞中大量表达,提示利拉鲁肽对糖尿病肾脏的保护可能与对肾小球血管内皮细胞的保护作用有关。本研究通过探讨利拉鲁肽对糖尿病大鼠UAlb排泄的影响及可能机制,旨在为临床研究提供参考。材料和方法一、实验材料1.成模、分组和干预10周龄雄性Wistar大鼠30只(天津市放射研究所),体重约400g。选取20只尾静脉注射STZ(45mg/kg)进行造模,1周后随机血糖≥16.7mmol/L即成模。成模后1周采用随机数字表法将大鼠分为糖尿病(DM)组、利拉鲁肽(DM+L)组,每组10只,分别予腹腔内注射生理盐水和利拉鲁肽0.3mg/kg,2次/d,干预12周。剩余10只正常大鼠为正常对照(NC)组。2.抗鼠enos、兔抗鼠、p-enos、p-enos、p-enos多克隆抗体的结构利拉鲁肽(诺和诺德公司),STZ(Sigma公司),兔抗鼠GLP-1R多克隆抗体(Abcam公司),兔抗鼠eNOS多克隆抗体、兔抗鼠p-eNOS(ser1177)磷酸化多克隆抗体(CellSignaling公司),eNOS测试盒(南京建成生物工程研究所)。二、实验方法1.血心肌生化指标各组干预前及干预后12周分别取血,采用葡萄糖氧化酶法检测血糖,全自动生化分析仪检测血肌酐(Scr)、BUN。造模前及处死前1d将大鼠放入金属代谢笼内,收集24h尿液,记录尿量后取4ml,2000r/min离心10min,去除沉渣,于-80℃待测。采用免疫比浊法检测UAlb。2.肾组织学检测干预12周后处死大鼠,分离左肾,去包膜将左肾沿纵方向对半剖开,一半放入10%中性福尔马林溶液固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,常规4μm切片,切片常规HE或PAS染色,常规清洗、脱水,封片,光镜下观察肾脏形态学变化。干预12周后,DM组3只死亡,DM+L组1只死亡。3.蛋白浓度检测取肾组织采用RIPA裂解液和匀浆器充分匀浆至完全裂解。14000g离心10min,留取上清,采用BCA法检测总蛋白浓度。采用12%分离胶和5%浓缩胶进行SDS电泳,转膜,脱脂奶粉封闭1h,4℃下置一抗于非脂牛乳中以1∶1000兔抗鼠GLP-1R、兔抗鼠eNOS和兔抗鼠p-eNOS抗体孵育过夜,TBST洗膜3次,山羊抗兔IgG二抗室温孵育1h(二抗按1∶2000稀释),TBST洗膜3次,DAB显色,凝胶成像系统记录实验结果。4.enos酶活性取肾脏组织匀浆液14000g离心10min,取上清液按1∶100稀释后用于检测eNOS活性。采用eNOS检测试剂盒进行检测,取100μl样品加入微孔板室温孵育30min,常规洗涤,加入酶结合物孵育15min,洗涤,底物显色,采用酶联免疫检测仪检测450nm吸光度值,严格按照试剂盒使用说明及文献进行。三、干预前后比较采用SPSS15.0软件进行统计学分析。计量资料以ue0af±s表示,同组干预前后比较采用配对t检验,两组间比较采用SNK检验,多组间比较采用方差分析。一、干预前的各组的数据表1二、血糖、scr、bun、24hub干预12周后,DM、DM+L组体重低于NC组(P<0.01),DM组降低更显著(P<0.01)。DM、DM+L组血糖、Scr、BUN、24hUAlb高于NC组(P<0.05或P<0.01)。与DM组相比,DM+L组血糖、Scr、BUN、24hUAlb降低(P<0.05或P<0.01)。(表2)三、基底膜不完整光镜下NC组肾小管、小管间质区结构清楚,肾小管上皮细胞呈方形,大小一致,排列整齐;基底膜完整无增厚,间质中未见炎症细胞浸润、纤维组织增生;未见肾小球硬化。DM、DM+L组肾小球体积增大,肾小球系膜区增宽,间质中可见炎性细胞浸润,纤维组织增生,DM组甚至可见肾小球硬化。(图1)四、glp-1r、p-enos检测Westernblot检测显示,各组肾脏eNOS表达比较差异无统计学意义,DM组GLP-1R、p-eNOS表达较NC组降低(P<0.01),DM+L组肾脏GLP-1R、p-eNOS表达较DM组增加(P<0.01)。(图2~3)五、关于血管内皮细胞ELISA检测显示,DM组eNOS活性较NC组降低(P<0.01),DM+L组eNOS活性较DM组升高(P<0.05)。(图4)利拉鲁肽可降低糖尿病患者心血管疾病患病风险,提示利拉鲁肽对血管内皮细胞有保护作用,也可减少糖尿病大鼠肾脏炎症因子表达,发挥对肾脏的保护作用。因此,肾脏是利拉鲁肽作用的靶器官。本研究结果显示,利拉鲁肽可降低糖尿病大鼠UAlb排泄,还可减轻肾脏形态学损害,DM+L组血糖虽降低,但仍高于NC组,提示利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏的保护作用不仅与降低血糖水平有关,还可能得益于其降糖外的作用。利拉鲁肽可降低糖尿病患者血管并发症风险,提示血管内皮细胞可能是利拉鲁肽作用的靶细胞。研究发现,eNOS敲除小鼠在STZ诱导产生糖尿病后会出现严重肾损害,这些病变与糖尿病慢性肾脏疾病(CKD)患者肾脏病变相似,即不仅会有早期特征,还出现CKD晚期特点,如系膜血管裂解、K-W结节形成、肾小球内胶原沉积、血管损害、肾小球硬化、肾间质纤维化等病理改变,同时还有高血压、大量蛋白尿及进行性肾功能衰竭。研究报道,第V结构域缺失型β2GPI可提高糖尿病大鼠肾脏eNOS活性,可降低糖尿病大鼠UAlb排泄。因此,eNOS活性降低是DN关键机制,提高糖尿病肾脏eNOS活性是DN防治的新靶点。ser1177位点磷酸化是eNOS激活的关键位点。本研究结果显示,糖尿病大鼠肾脏eNOS表达并无明显下降,但其eNOS(ser1177)磷酸化表达下降、eNOS活性降低。DM+L组肾脏p-eNOS及eNOS活性均提高。因此,利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏保护作用可能也得益于其改善糖尿病大鼠肾小球血管内皮细胞eNOS活性,从而改善内皮细胞功能紊乱的状况。此外,DM+L组肾脏GLP-1R表达上调与肾脏eNOS磷酸化及活性提高一致,提示GLP-1R后信号通路可能参与糖尿病肾脏eNOS活性的调节,但具体机制还有待进一步研究。推断利拉鲁肽对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制可能为利拉鲁肽