菌种保藏操作规程

菌种保藏操作规程目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。编制依据：实验室生物安全通用要求（GB19489-2008）实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T27405-2008）；中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的菌种保藏方法；《微生物学实验（第四版）》沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；《食品微生物实验技术》，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下：1.1试剂、培养基种类营养肉汤或BHI培养基适用于所有细菌（除真菌外）的増菌；营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。1.2试剂、培养基制备按照说明书要求溶解培养基并调pH值。将配好的培养基趁热分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4-5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，15-20min。斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1-3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。1.3接种点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如黑曲霉）等。中央划线：从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，白假丝酵母）等。密波状蜿蜒划线法：从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，白假丝酵母）等。1.4培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30-37℃，真菌培养温度一般为25-28℃。1.5保藏：培养好的菌种于4-6℃覆膜保存，黑曲霉、枯草芽孢杆菌每3-5个月移植一次，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌每月移植一次，白假丝酵母菌保藏间隔为2个月。湿度用相对湿度表示，通常为50%-70%。1.6菌种复苏：无特别要求，将菌株从冰箱取出至常温后直接转接。2甘油冷冻法由于加入生理盐水能降低甘油的高渗作用，因此甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液。其主要原理是靠低温来降低微生物活性，达到保存的目的。加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞，甘油还有隔绝空气、衡湿、调节渗透压、并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用。2.1甘油-生理盐水保存液制备取甘油(分析纯)8份加入生理盐水（0.9%）2份，充分混合后，经121℃，30min灭菌后备用。2.2培养基制备同斜面定期移植法。2.3菌种保存管用带盖小塑料离心管,包装后高压蒸汽灭菌,经121℃，30min灭菌后烘干。2.4方法步骤将冻干菌种复溶液增菌，根据菌种不同分别划线接种不同培养基于37℃培养18-24h。用接种针取上述典型菌落接种营养肉汤管，37℃恒温振荡培养箱培养4-6h(亦可置于普通温箱培养6-8h)，真菌用接种环取菌洗入肉汤管，不做培养。然后按5份培养液加入2份保存液的比例加入已灭菌的保存液,分装于已作好标记的菌种保存管，每管约0.2ml盖紧，每株细菌保存多支，置-20℃冰箱保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）.次日每种菌取一管于37℃水浴中快速解冻融化，接种于适宜培养基,确证生长良好且无污染，所余各管即可长期保存。保存过程中切忌融化。2.5保藏时间：此法保存效果良好，主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏，一般菌类保存期限为2-4年。2.6菌种复苏：使用时取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂平板复苏。3液体石蜡法亦称矿物油保藏法，斜面定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4-6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。操作步骤如下：3.1无菌液体石蜡的制备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，可采用以下两种方式进行灭菌：121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。3.2斜面培养物的制备参照斜面定期移植法。3.3灌注石蜡将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。3.4保藏注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4-6℃）干燥处保藏，黑曲霉、枯草芽孢杆菌保藏时间2年以上，白假丝酵母1-2年，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌保藏1年。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。3.5菌种复苏此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存。恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意，尤其是保藏致病菌更需小心。4瓷珠保藏法冻存管里的小瓷珠表面多孔，细菌可以很方便的吸附在上面。冻存管接种上细菌后，可放置于-20℃环境中长期保存。（-20℃可保存一年）4.1菌种保存使用前用油性笔在每个冻存管上标记上细菌的名称。每支冻存管只可接种一种细菌。在无菌条件下，打开冻存管的螺旋瓶盖。用接种环挑取18-24小时新鲜细菌纯培养物，放入冷存液中。拧紧瓶盖，来回颠倒使细菌乳化，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液。此时菌悬液会吸附在小瓷珠内外表面。用无菌移液枪将冻存管中的菌悬液尽量吸出。（吸出的菌悬液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理）。拧紧瓶盖。记录下接种细菌的详细情况。将接种完细菌的冻存管放在-20℃冰箱保存。4.2菌株复苏取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出小瓷珠，拧紧瓶盖。尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生存能力。取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。4.3注意事