生物化学实验-糖酵解中间产物的鉴定

糖酵解中间产物的鉴定2006.11精选ppt一、目的

通过回顾糖酵解和三羧酸循环的代谢过程，明确本实验鉴定的代谢的中间产物所处的代谢阶段及相关的酶，了解实验设计的思路。加深对糖酵解过程的感性认识。精选ppt二、原理在代谢正常进行时，中间产物的浓度往往很低，不易分析鉴定。若加入某种酶的专一性抑制剂，则可使其中间产物积累，便于分析鉴定。3-磷酸甘油醛是糖酵解的中间产物，利用碘乙酸对3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用，可使3-磷酸甘油醛不再转化而积累，同时加入硫酸肼作稳定剂，积累的3-磷酸甘油醛就不会自发分解。用羰基试剂2,4-二硝基苯肼与其在偏碱性条件下反应，生成3-磷酸甘油醛-2,4-二硝基苯腙，再加过量的氢氧化钠即形成棕色复合物，其棕色深度与3-磷酸甘油醛含量成正比。精选ppt糖酵解三羧酸循环酶的专一性抑制、非专一性抑制、不可逆抑制本实验涉及的知识点有：精选ppt糖酵解概念生物学意义反应历程把葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解途径（EMP）。产生能量——净产生2分子ATP;产生一些代谢中间产物，为生物合成提供原料。三个阶段十步反应。己糖磷酸化磷酸己糖的裂解3－磷酸甘油醛生成丙酮酸精选ppt己糖激酶葡萄糖6－磷酸葡萄糖6－磷酸果糖1，6－二磷酸果糖磷酸己糖异构酶磷酸果糖激酶ATPATP1.己糖磷酸化2.磷酸己糖裂解3.ATP和丙酮酸的生成1，6－二磷酸果糖磷酸二羟丙酮＋3－磷酸甘油醛醛缩酶3－磷酸甘油醛1，3－二磷酸甘油三磷酸甘油醛脱氢酶丙酮酸精选ppt丙酮酸的去路：有氧条件：CO2+H2O三羧酸循环、电子传递链无氧条件：生成乙酰CosA生成乳酸生成乙醇精选ppt涉及的反应：苯腙精选ppt几种主要试剂的作用：硫酸肼——？碘乙酸——？三氯乙酸——？稳定剂3－磷酸甘油醛脱氢酶的抑制剂蛋白质、酶的变性剂3－磷酸甘油醛脱氢酶活性中心有半胱氨酸，为巯基酶。碘乙酸可与之发生反应，为不可逆抑制。精选ppt三、操作步骤1．加试验材料和试剂取3支10mL离心管，编号，分别称取并加入干酵母0.1g，再按下表加试剂，加完试剂后，每管中插入一支玻璃棒，搅匀，玻璃棒留在管中。试剂管号ⅠⅡⅢ5%葡萄糖（mL）5555%三氯乙酸（mL）1000.002mol/L碘乙酸(mL)0.50.500.56mol/L硫酸肼(mL)0.50.50精选ppt2.保温和观察气泡

将上述三支离心管（连同玻璃棒）置于37℃水浴中的试管架上保温10min。观察各管生成气泡的量有无不同，为什么？3.补加试剂试剂管号ⅡⅢ5%三氯乙酸(mL)110.002mol/L碘乙酸(mL)00.50.56mol/L硫酸肼(mL)00.5加完试剂后，用管中玻棒搅匀，取出玻棒，静置3min。4．离心将上述三支离心管中的反应液分别离心（离心前先平衡），然后留上清液备用。3000rpm3min.精选ppt5．显色和观察结果

取3支15mL试管，编号，分别加入上述相应的上清液0.5mL，并按下表加入试剂和处理，每加完一种试剂，各管均要摇匀。最后，观察各管颜色深浅有无差异，哪管最深？哪管最浅？为什么？试剂管号123上清液（或滤液）（mL）0.50.50.50.75mol/L氢氧化钠（mL）0.50.50.5室温放置1min2,4-二硝基苯肼（mL）0.50.50.5室温放置1min0.75mol/L氢氧化钠（mL）3.53.53.5观察颜色深浅精选ppt注意事项：1．本实验虽为定性鉴定，但在称重和量取体积时仍要求相对准确。2．应随实验材料来源不同，摸索适宜的保温时间。精选ppt四、结果分析描述观察到的实验现象并对实验结果加以分析。包括保温后气泡量及最后