药物毒性的代谢组学研究-中国药理学会毒理学研讨会

药物毒性的代谢组学研究彭双清军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心剂量药物毒物药物发现与发展新化学实体(NCEs)新生物实体(NBEs)有效性安全性药效学毒理学管理规范ICH

(InternationalConferenceonHarmonization)100,000NCEs临床前研究100人体研究(0.1%)10-20个新药投入市场(0.01-0.02%)药物发现发展过程中候选新药的淘汰率2个新药利益回报(0.002%)早期发现临床前临床试验投放市场市场后

IVIIIIIICSFHDRSToxicology6-15Ys早期毒理学研究(nondefinitivetoxicologyprofile)正式毒理学评价(definitivetoxicologyevaluation)通过给予一定数量的实验动物大剂量的待测化合物，观察其毒性效应特征，然后将其实验结果外推到接受小剂量相同化合物的大量人群。药物安全性评价

存在问题种属外推剂量外推实验周期费用昂贵

发展方向灵敏度高特异性强周期短Inputs:Noxiousagent/StressorOutputs:Biologicalendpoints;PathologyGeneexpressionProteinprofileMetabolicprofileTimeTime代谢组学(Metabonomics)•定量研究机体对病理生理刺激或遗传变异的，与时间相关的多参数代谢应答(Nicholson,etal,Xenobiotica,1999,29,1181-1189).•通过分析机体生物组织液体中代谢产物谱的变化，研究机体整体生物学状况和功能调节。•利用核磁共振和模式识别方法对生物体液进行系统研究，了解由外源性物质(药物)的作用而引起的内源性代谢产物的变化，并将这种变化与核磁共振谱图的模式对应起来，从而找出作用的靶器官和作用位点，进而确定与之相关的生物标志物。基本原理

药物毒性破坏正常细胞的结构功能，改变细胞代谢途径中内源性代谢物的稳态。体内某种生物分子或代谢物的动态变化可以作为毒性损伤的评价指标。血浆或尿液代谢物的“整体模式”比单一靶标具有更好的一致性和预见性。关键技术

NMR与模式识别是实现代谢组学的关键技术手段。

(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)样本采集谱图采集统计分析生物标志物量化处理肝、肾毒性的代谢组学检测JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002

大鼠尿液功能性NMR图谱大鼠尿样的600兆NMR氢谱,图中标示的为各种病理生理条件下的生物标志物,一张谱图可包含数百种有关疾病和中毒过程的信息

。(JK.Nicholsonetal.NatureRev.DrugDiscov.1,153,2002)技术特点与应用

特点:无伤害性，快速简便，动态检测。应用:基因功能研究

●疾病诊断毒理学研究:

确定毒性靶器官；确定作用靶位及其机制;确定毒性作用生物标志物；评价毒性效应过程(启动、发展与转归)。药物安全性评价:早期毒性实验；快速动物模型筛选；先导筛选优化；发现临床前新安全标志物；作用机制；代谢类型；临床安全性监测；等等。异烟肼和利福平联合用药致肝毒性增加的代谢组学

近十年来，结核病发病率在全球范围内出现严重反弹。异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampin，RFP)是WHO推荐的标准抗结核化疗方案中不可替代的一线抗结核药。两药联合对杀灭结核杆菌有协同效果，可延缓耐药性的产生。但联合用药可明显增加肝毒性，甚至可发生严重的药物性肝炎，出现致命的急性肝坏死并肝功能衰竭。关于RFP与INH合用肝毒性增加的机制研究已有30多年，但目前在很多方面，还未得到公认和肯定。实验设计剂量设计：Group1:control;Group2:INH400mg/kg;Group3:RFP100mg/kg;Group4:INH+PFP400+100mg/kg实验动物：Wistar大鼠给药时间:14dINH与RFP联合用药对大鼠体重和肝指数的影响分组体重(15d)(g)肝指数(mg/g)Con249.54±14.67@4.138±0.05@INH193.30±20.98*4.416±0.04*

@RFP215.92±7.36*@4.394±0.03*

@INH+RFP187.94±16.40*4.784±0.15*

N=5;*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.INH与RFP联合用药对大鼠血浆生化指标的影响分组ALT(U/L)ALP(U/L)TG(U/L)TBILI(U/L)Con15.80±3.83@274.00±51.44@0.13±0.084.72±0.73@INH32.60±2.70*335.60±52.63*0.67±0.27*@5.66±0.61*@RFP26.20±5.53*@276.20±31.16@0.21±0.064.42±0.51@INH+RFP38.20±4.82*348.00±43.86*0.26±0.1113.02±0.52**P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.

INH和RFP单独及联合用药对大鼠肝匀浆MDA、总巯基、非蛋白巯基和蛋白巯基含量的影响

*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.INH和RFP单独及联合用药对大鼠微粒体细胞色素P450含量及P4502E1活性的影响

*P<0.05,comparedwithGroup1;@P<0.05,comparedwithGroup4.组织病理学结果A:controlratsshowingnormalmorphology.B:400mg/kg/dayINHfor14days.Notethenecrosisfocus.C:100mg/kg/dayRFPfor14days.Noobviousnecrosis.D:400mg/kg/dayINHand100mg/kg/dayRFPfor14days.Notethenecrosisfocusandbigandsmallblankarea.

INH和RFP单独及联合用药组尿液600MHz1H核磁共振谱

对照组(N)与给药组(I=INH400mg/kg/d,R=RFP100mg/kg/d,P=INH+RFP400+100mg/kg/d)共14天(0=0d,1=1d,…14=14d)尿样的PCA分析结果INH和RFP单独及联合用药组不同时间点尿液代谢组变化主成分分析散点分布图（给药14d）INH组主成分分析的时间变化轨迹图（连续给药14d）

N＝control,

I=INH;0=0d,1=1d,…14=14d

RFP组主成分分析的时间变化轨迹图（连续给药14d）

N＝control,

R=RFP;0=0d,1=1d,…14=14dINH和RFP联合用药主成分分析时间变化轨迹图（连续给药14天）

N＝control,

P=INH+RFP;0=0d,1=1d,…14=14dloading

图INH组尿液代谢产物主成分分析载荷分布图

RFP组尿液代谢产物主成分分析载荷分布图

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图INH和RFP联合用药组尿液代谢产物主成分分析载荷分布图

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图INH组RFP组INH和RFP组1H谱的化学位移(δ)代谢产物PCA结果1H谱的化学位移(δ)代谢产物PCA结果1H谱的化学位移(δ)代谢产物PCA结果2.54citrate

2.462-OG

2.42succinate2.66citrate2.54citrate2.462-OG2.7citrate

2.7citrate

2.54citrate3.26taurine3.022-OG2.66citrate3.42taurine

2.7citrate3.66glucose3.022-OG3.26taurine：与对照比较，代谢产物浓度增加；：与对照比较，代谢产物浓度降低

2－OG：2－oxoglutarate表31HNMR检测INH和RFP单独及联合用药组化学位移变化的PCA结果结果表明：·对NMR谱图进行主成分分析（PCA）发现，INH和RFP单独及联合用药组与对照组在分值散点图中呈聚类型分布，各组间未见重叠，可明显分离；·代谢产物谱与血液生化、肝脏脂质过氧化、肝脏微粒体酶活性及组织病理学具有良好的相关性；·尽管使用传统生物分析方法较容易检测到一些代谢物，但是药物处理组尿液的NMR谱图却可以提供毒物所诱发生化紊乱的显著特征性信息和时效模式。·通过600MHz1HNMR检测INH与RFP单独及联合用药组尿液的生化组成的显著变化。·INH-:牛磺酸()*,柠檬酸(),葡萄糖()·RFP-:2-酮戊二酸(),柠檬酸盐()·INH+RFP:牛磺酸()*,琥珀酸盐(),2-酮戊二酸(),柠檬酸盐()*尿液中牛磺酸浓度的增加被公认为是肝中毒的标志。关木通的肾毒性关木通马兜铃科马兜铃属植物东北马兜铃的干燥藤茎含马兜铃酸（aristolochicacid）Ⅰ、Ⅳ、B、D，马兜铃甙（aristoloside），青木香酸（debilicacid）“中草药肾病”“马兜铃酸肾病”含有马兜铃酸的中草药（广防己、关木通等）引起的肾功能损害：贫血、肾性糖尿肾间质纤维化、肾小管破坏肾小管性蛋白尿国内外反应：许多国家禁止进口和销售含马兜铃酸的中药国家药品监管局取消关木通药用标准“龙胆泻肝丸”换方10/14/2023实验设计剂量设计：36g/kg；32g/kg；28g/kg；control实验动物：Wistar大鼠给药时间:6dRatstreatedwithdrugfor6days.**P<0.01,comparedwithcontrol.关木通对大鼠血浆生化指标的影响BUN(mM/L)

Crea(μmol/L)CON

7.38±2.9154.72±4.94

36g/kg

40.91±8.59**414.47±79.13