第二章 第五节(2)蛋白质工程

蛋白质工程

蛋白质工程蛋白质工程：是以蛋白质空间结构及其与生物学功能的关系为基础，通过分子设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，而实现的对天然蛋白质的定向改造。目的：是为构造并生产性能比现有蛋白质更加符合人类需要的蛋白质新品种提供科学依据和技术途径，同时，为分子生物学的基础理论研究提供强有力的新手段。蛋白质的结构

1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang首次提出蛋白质三级结构的概念：一级结构：指多肽链中氨基酸的一定的顺序，靠共价键维持多肽链的连接，而不涉及其空间排列。二级结构：指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。三级结构：指整个肽链的折叠情况，包括侧链的排列，也就是蛋白质分子的空间结构或三维结构。1958年英国晶体学家Bernal提出四级结构概念：四级结构：指蛋白质亚基的排列。

蛋白质的超二级结构和结构域

超二级结构：1973年Rossman提出，指二级结构的组合物。结构域：由Porter提出，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。蛋白质工程就是对自然界存在的蛋白质加以改造，改造的目的是得到性能更符合人类要求的非天然蛋白质，以用于工业、农业、医药卫生等各领域。蛋白质改造的方法：通过改造它们的基因，再用基因工程的方法由工程菌种来生产新的蛋白质。与药物设计的关系：近年来随着药物设计发展的需要，基于生物大分子结构知识的药物设计已成为药物发展中的重要领域，由于这种设计途径在很大程度上与蛋白质工程有着深刻和广泛的联系，因此往往在学术上与蛋白质工程一起讨论。三类专家：①蛋白质空间结构测定的专家；②蛋白质分子设计的专家；③基因工程的专家。空间结构测定的专家：主要应用X射线晶体结构分析的方法与技术对蛋白质分子的空间结构进行实验测定。分子设计专家：在了解了需要改造的蛋白质的性能及其相应的结构基础之后，主要通过理论的方法，提出蛋白质改性的设计方案，这一方案将提供改性后的蛋白质哪些部分的氨基酸顺序与天然蛋白质不同，这些新的序列可以导致怎样的空间结构和电子结构的变化，从而能赋予新蛋白质什么样的特性。当前的分子设计主要以能显示图形图象的计算机为工具，采用基于物理学原理的各种模拟方法和基于蛋白质的改性分子结构知识的模型构建方法，或兼用这两类方法。基因工程专家：在得到了新的蛋白质的改性设计方案之后，就用一套分子生物学的技术，先合成相应的基因模板，再经过克隆与表达，得到新蛋白质的产物，最后通过分离、纯化，提取出足够纯的新蛋白质以研究它的性质。蛋白质工程的这一程序不是一次就能实现的，往往要经过多次的循环，不断改进设计方案才能发现一个理想的新改性蛋白。当前蛋白质工程研究的热点：一方面是对具有明显生物学功能的天然蛋白质分子；另一方面是基于生物大分子结构知识的药物设计。蛋白质人为进化

定向进化随机突变定向进化

随机突变+选择体外定点突变定向进化原理：在待进化基因的PCR扩增反应中,利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质,配合适当条件,以很低的比率向目的基因中随机引入突变,构建突变库,凭借定向的选择方法,选出所需性质的优化蛋白质,从而排除其他突变体。定向进化的基本规则：“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。与自然进化不同,前者是人为引发的,后者虽相当于环境,但只作用于突变后的分子群,起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。体外定点突变在已知的DNA的序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变蛋白质结构中的个别氨基酸的序列。随机突变易错PCRDNAshuffling高突变菌株交错延伸体外随机引发重组杂合酶易错PCR易错PCR：是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。原理：通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。DNAshufflingDNAshuffling：即将DNA拆散后重排。它是模仿自然进化的一种DNA体外随机突变方法。这种方法不仅可以对一种基因人为进化，而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组，共同进化出一种新的蛋白质。

DNAshuffling基本过程包括四个步骤：1、目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因；2、DNaseI酶切：将基因随机切割成约10-50bp或300bp左右的小片段；3、不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组；4、加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物，使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变,得到的正突变子又可以重复进行DNAshuffling，使性状进一步提高。高突变菌株背景：对大肠杆菌的研究表明，在野生型的菌株中自发突变率约为每世代每细胞中1010基因上有一个突变。实例：Greener构建了一株新的菌株，命名为XL-1-RED，它由XL-1-MRA衍生而来，在错配修复外切酶活性亚基上发生突变，因此它的自发突变率比野生型高5000倍，在培养30代后，XL-1-RED的自发突变率可达到千分之一。这种突变可以是转换、颠换或插入。

交错延伸交错延伸（staggerextensionprocess,StEP）的原理：在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间(55℃,5s),从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。优点：StEP法重组发生在单一试管中,不需分离亲本DNA和产生的重组DNA。它采用的是变换模板机制,这正是逆转录病毒所采用的进化过程。该法简便且有效,为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具。

体外随机引发重组体外随机引发重组（random-priminginvitrorecombination,RPR）：以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段,由于碱基的错配和错误引发,这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整的基因长度。如果需要,可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质。该法优于DNA改组法的特点在于：（1）RPR可以利用单链DNA为模板,故可10～20倍地降低亲本DNA量;（2）在DNA改组中,片段重新组装前必须彻底除去DNaseⅠ,故RPR方法更简单;（3）合成的随机引物具有同样长度,无顺序倾向性。在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变;（4）随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制。杂合酶杂合酶（hybridenzyme）：是把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能域）或整个酶分子进行组合或交换,以产生具有所需性质的优化酶杂合体.杂合酶产生途径：如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合。杂合酶可用于改变酶学或非酶学性质,是了解酶的结构-功能关系、以及相关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界不存在的反应的新酶分子。杂合酶方法的有效性和实用性已得到了实验的证实。

成功实例：在1987年美国杜邦公司的DeGrado等人就利用当时已积累的蛋白质分子空间结构与构象的规律，经过精心的设计并由多肽合成发产生了一个由74个氨基酸组成的非天然蛋白质。它具有设计者所期望的4股α螺旋结构。tRNA介导的蛋白质工程tRNA-mediatedproteinengineering（TRAMPE）通过拓展遗传密码，从而可以将人为设计的非天然氨基酸选择性掺入蛋白质，它可以提供蛋白质信息，改进蛋白质的检测与分离方法。蛋白质剪接原理：由蛋白质内含肽所介导。是一个蛋白质翻译后的加工过程，它由一系列分子内的剪切一连接反应组成。蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显子连接成成熟的蛋白质。模体骨架嵌合体蛋白质蝎毒素α/β模体骨架嵌合体蛋白质CD4R2环（36-47aa）与蝎毒素α/β模体骨架嵌合，阻止HIVgp120与CD4结合。改造工业用酶1、合理设计2、定向进化作用：1、提高酶的稳定性2、提高酶的活性3、增强酶的选择性4、改变酶的表面活性

成熟蛋白质常规修饰N端-乙酰化（Acetylation）甲酰化（Formylation）C-端酰胺化（Amidation，C-termainal）磷酸化（Phosphorylation）生物素修饰（Biotin）环化修饰（N-端和C-端首尾成环、Lys和Asp或Glu环化、其他环化修饰）肉豆蔻酸（Myristoyl）香豆素修饰pGlu焦谷氨酸修饰荧光修饰FITC（异硫氰酸）荧光修饰FAM荧