第十二章 遗传工程

第十三章遗传工程（P256）第一节遗传工程概述

遗传工程（P257）：指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。广义遗传工程包括:

细胞工程、酶工程、发酵工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义遗传工程是指:

基因工程(重组DNA技术)。一、基因工程概述:

概念（P256）

：

利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。

第二节基因工程20世纪70年代诞生2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。基因工程基因工程操作的对象是DNA分子。又称为重组DNA技术。基因工程在体外切割、拼接，构建重组DNA分子；将重组DNA分子导入受体细胞或生物体；使外源基因在受体内复制、转录、翻译，并使受体的遗传特性得到修饰或改变。有性杂交和基因工程通过有性杂交实现遗传重组，在获得目标性状的同时常常伴有其他不需要的性状改变。通过基因工程只转移个别基因，只改变目标性状。基因工程与有性杂交相比较的优越性：跨越物种障碍只改变个别性状人为控制表达步骤(P257)：

①．从细胞和组织中分离DNA；②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③．将酶切DNA分子与载体DNA连接,构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制；⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞,建立无性繁殖系(Clone)或发育成个体；⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系或个体。二、基因工程的工具酶（P258）：

限制性核酸内切酶（限制酶）

DNA连接酶

反转录酶（逆转录酶）（一）限制酶（P258）：

是在识别双链DNA分子中某些特定核苷酸序列的基础上，切割DNA双链的内切酶。目前已分离和鉴定出200多种不同的限制酶

限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。1、限制性内切酶的命名：

根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；

如:EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)2、限制性内切酶的类别：

第Ⅰ类酶、第Ⅱ类酶、第Ⅲ类酶共性：只切割双链DNA分子，需要镁离子激活。识别和切割位点：回文结构4～6bp出现两种末端：粘性末端(粘端)平头末端(平端)

第Ⅱ类限制性酶粘性末端与平头末端（二）DNA连接酶(P260):

催化DNA中相邻的3’-OH和5’-磷酸基末端之间形成磷酸二脂键并把两段DNA连接起来。(三）逆转录酶（P260）以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，又称依赖于RNA的DNA聚合酶。在基因工程中主要用途是以mRNA为模板合成互补的DNA链（complementary,cDNA）.三、载体（P262）

载体是将外源基因送入受体细胞的工具。

可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体BAC、YAC等

（一）载体的条件(P262)：①在宿主细胞中能独立复制，有独立的复制起始位点；②.载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，即限制酶切位点又称多克隆位点；③.有选择标记，便于选择含重组DNA分子的宿主细胞；④.相对分子质量小，多拷贝，易于操作。PUC19质粒（二）载体种类载体有多种，对载体的分类方法较多1、据使用目的分类（1）克隆载体：繁殖目的基因，称克隆载体（2）表达载体：表达目的基因

2、据载体来源分（1）质粒

（2）噬菌体如:λ-噬菌体（3）人工载体：YAC、BAC(1)质粒载体(P264)：

质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体外存在的一种能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。

质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。

如pUC18质粒具有以下特点(P280)：①.

分子量小，可接受较大外源片段(<10Kb)；②.拷贝数多，每个细胞中有500个；③.克隆位点的酶切位点多，克隆方便；④.具有a－互补显色表型，用于检测重组质粒的选择标记。缺点：质粒携带的外源基因小于10Kb

互补

在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有－半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码序列。在这一编码区中插入有一个多克隆位点。细菌细胞含有野生质粒（没有外源DNA插入），在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的培养基上培养时产生蓝色菌落，易于识别。当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，lacZ基因失去功能，不能代谢X-gal因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落(阳性克隆)。细菌是否携带质粒的筛选：质粒携带氨苄青霉素抗性基因。在培养基中加入氨苄青霉素。携带质粒的细菌保留下来，不携带质粒的细胞被杀死。质粒载体的筛选：细菌是否携带质粒？质粒是否携带外源DNA？质粒是否携带外源DNA的筛选（互补显色反应）:如果质粒不带外源DNA，lacZ基因的产物能够参与形成完整的β－半乳糖苷酶；该酶能把培养基中的X－gal（5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）分解成半乳糖和5－溴－4－氯靛蓝；5－溴－4－氯靛蓝呈深蓝色。如果质粒携带外源DNA，则lacZ基因被破坏，细胞不能形成完整的β－半乳糖苷酶，菌落呈白色。(2)病毒载体（P281）

以λ噬菌体为例：基因组全长48kb。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响浸染细菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，既可做克隆载体又可做表达载体。

(3)克隆大片段DNA的载体：

以细菌人工染色体（BAC）为例：

F因子经基因工程改造成BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。

特点：

带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；多克隆位点。载体本身分子量很小(7.4kb)；选择标记：氯霉素抗性基因；

四、DNA的体外重组1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接；2.目标DNA分子+载体

DNA，共价连接；3.获得重组DNA分子。

五、目的基因的分离与鉴定㈠、基于基因文库的基因分离方法（P267）：1.构建基因库（library）：

基因文库是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。

①.基因组文库(genomiclibrary)

：

将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。②.cDNA文库：

以mRNA为模板è经逆转录酶合成cDNAè构建基因库。基因组文库与cDNA文库的比较：

基因组文库包含基因组的所有基因。cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列。分离特定基因，cDNA库比较方便。研究调控序列，必须基因组文库。2.从基因库中分离特定的基因：①.DNA探针：是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆；制备的探针可以是双链也可以是单链，但在杂交反应中使用的是单链；探针必须带有标记，如同位素、荧光素等②.筛选基因库：将转化或转染后菌落印影在滤膜上；用碱裂解使双链DNA变性成单链，牢固地结合在膜上；再用变性过的目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交放射性自显影，凡X光片上有黑点即为阳性克隆定位找出培养皿所对应的菌落③.序列测定和分析：

从基因库中筛选出的阳性克隆è

分析、鉴定è

得到目的基因。

一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法(dideoxynucleotidechaintermination)测定核酸序列。5’TACGCATACGACATTGCAAC3’ddTATGCTGTAACGTTG5’ddTGCGTATGCTGTAACGTTG5’ddTGCTGTAACGTTG5’ddTGTAACGTTG5’待测序的DNA模板引物DNA聚合酶dNTPddTTPSanger双脱氧链终止法ddTAACGTTG5’ddTTG5’ddTG5’电泳方向㈡、T-DNA标签分离基因（P286）：T-DNAT-DNA㈢、基于PCR的基因克隆：聚合酶链式反应(