肾络宁对iga肾病大鼠肾小管间质损害的干预作用

肾络宁对iga肾病大鼠肾小管间质损害的干预作用

采用中药复方肾络宁治疗iga肾病取得良好的临床效果，采用牛血清蛋白b和乳突肠毒素b的复合感染法制作了iga肾病模型。通过常规的生物化学和病理分析，采用原代异交、免疫组化和计算机图像分析系统进行观察和分析。i-1（图gf-1）基比妥-1（pmp-1）基比妥-1（图根比妥-1）磷酸酶-1（pmp-1）和i-1（imp-1）对氨基金属酶-1（5mmp-1）和氨基金属酶-1（imp-1）的影响，如下报告。材料和方法1药物、药品与药物牛血清白蛋白(BSA)由中国医学科学院血液病研究所提供,葡萄球菌肠毒素B(SEB)由解放军军事医学科学院微生物流行病研究所提供。完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂由天象人生物有限公司提供。肾络宁由柴胡、黄芪、女贞子、白花蛇舌草、山楂等组成,药物购自天津中医药大学第一附属医院中药房,按比例称取后加水浓煎至3g/ml;肾炎康复片由天津同仁堂制药厂提供。2各组及治疗方法选用健康SD大鼠40只,雌雄各半,体重(100±20)g,由解放军军事医学科学院四所提供。经普通饲料适应性饲养1周后,查尿红细胞、蛋白阴性。随机分为正常组、模型组、肾络宁组、肾炎康复片组,每组10只。模型组与肾络宁组及肾炎康复片组自实验第1d隔日灌服BSA100mg/kg,0.1%稀盐酸配制。第6周尾静脉注射BSA10mg/kg,以生理盐水稀释。每日1次连续3d。第8周尾静脉注射SEB0.4mg/kg,生理盐水稀释,每周1次连续3d,同时腹腔注射弗氏佐剂0.2ml。肾络宁组及肾炎康复片组,自实验的第1d起灌服以成人剂量/kg体重15倍剂量的浓缩药液,正常组以等量生理盐水灌胃。实验共进行16周。3计数红细胞指标(1)尿红细胞艾迪氏计数:用代谢笼收集12h尿液,用量筒称量后取其中一部分离心,1800r/min,离心15min,弃上清液将尿沉渣滴于计数盘内,低倍镜下计数红细胞。(2)24h尿蛋白测定:比色法,使用半自动生化分析仪(VITALABMICRO,荷兰)检测,试剂盒由天象人生物工程有限公司提供,批号:0102150。(3)血肌酐、尿素氮测定:苦味酸法,使用半自动生化分析仪检测(荷兰),试剂盒由天象人公司提供。(4)尿N-2酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性测定:比色法,采用721分光光度计检测,试剂盒由上海太阳生物技术公司、上海亚都生物技术研究所提供。批号:TY0109。4免疫荧光检测脏器超微结构的制备(1)光镜:肾脏标本用10%福尔马林固定,石蜡包埋切片(3μm),分别作HE、PAS、Massion染色,观察组织形态学变化。(2)电镜:新鲜标本用6%冷戌二醛固定,1%锇酸后固定,乙醇逐级脱水Epon812树脂包埋,定位后制成600×10-10m厚的超薄切片,醋酸铀及柠檬酸铅双染色,PlipisEN400-ST电镜下观察肾脏超微结构的变化及有无电子致密物。(3)免疫荧光:检测抗体IgA,用组织包埋后,液氮速冻,由Leica2800型冰冻切片机(法国产)制成4μm厚的冰冻切片,贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,室温下晾干,0.1MPBS缓冲液洗涤3min,洗2次,滴加异硫氰酸荧光标记的羊抗鼠IgA抗体(上海康成生物工程公司提供)。室温放置1h,PBS洗涤5min,洗3次,晾干后甘油封片,在Nikon荧光显微镜下观察IgA沉积情况,以亮绿色为阳性染色。5免疫组化检测5.1试剂与试剂以及试剂TGF-β1原位杂交及免疫组化试剂盒,Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒、PAI-1原位杂交试剂盒、MMP-1原位杂交试剂盒、TIMP-1原位杂交试剂盒,以上试剂均购自武汉博士德生物有限公司。5.2制备物、试剂和仪器新鲜肾组织以OCT包埋后液氮速冻,由Leica2800型冰冻切片机(法国)制减3μm厚的冰冻切片,加入1/1000DEPC的冷丙酮室温固定30min,然后用蒸馏水洗涤3次;新鲜配制0.5%H2O2/甲醇室温30min以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗涤5min×3次;滴加3%柠檬酸新鲜稀释的复合消化液,37℃消化120s,以灭活内源性过氧化物酶0.5MPBC水洗5min×3次;杂交:杂交盒底部加250ml蒸馏水,每张切片滴加20μl含寡核苷酸探针的原位杂交液,恒温箱37℃杂交过夜;洗涤:2×SSC洗涤5min×3次;稳定杂交探针:每张切片取2μl杂交探针稳定液A和18μl杂交探针稳定液B混匀(临时配制),滴在切片上,湿盒中37℃后应5min。2×SSC洗涤5min×3次;滴加封闭液;37℃20min,甩去多余液体;滴加免抗地高辛:37℃10min,0.5MPBS洗涤2min×3次;滴加生物素化辛抗兔IgG:37℃30min,0.5MPBS洗涤5min×4次;DAB显色,使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴混匀滴加至标本上,显色30min后充分水洗;苏木素轻度复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明,树脂封片。本实验以不加探针作为阴性对照。镜下观察拍照,阳性物质呈棕黄色。5.3单克隆抗体sabc肾组织常规10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋,切片厚度3～4μm,采用SABC法,切片脱蜡至水;蒸馏水新鲜配制0.3%H2O2,室温灭活内源性过氧化物酶,TBS洗5min×3次;抗原热修复,将切片浸入0.1MpH6.0的枸椽酸盐缓冲液中,92℃加温保湿20min;滴加TBS稀释的羊抗大鼠α-SMA、FN、ICAM-1单克隆β抗体,过夜。TBS洗5min×3次;滴加稀释的小鼠抗羊二抗,室温30min,TBS洗5min×3次;滴加稀释的SABC复合物,室温30min,TBS洗5min×3次;滴加DAB-H2O2显色液显色,苏木素轻度复染,封片。镜下观察拍照,阳性物呈棕黄色。6半定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色图像分析系统,对各组动物肾小管间质组织切片进行半定量分析。每个标本随机选取5个阳性视野,于200～400倍高倍镜下,测量每个视野中肾小管间质阳性区域面积与所测量区域的总面积百分比,计算出平均值,以该值作为TGF-β1、Col-Ⅲ、PAI-1、MMP-1及TIMP-1在肾小管间质中的相对含量。7统计方法采用SPSSforWindows10.0统计软件,对实验数据进行多组间单因素方差分析。结果1血胱之水作用从表1结果提示,肾络宁及肾炎康复片均有减轻IgA肾病大鼠血尿、蛋白尿、降低血肌酐、尿素氮及NAG活性的作用。在减轻蛋白尿、血肌酐、尿素氮方面肾络宁组略优于肾炎康复片组,但无统计学意义;而在减少尿红细胞、降低NAG治性方面肾络宁组优于肾炎康复片组(P<0.01或P<0.05)。2病理结果2.1肾络宁及肾康复片对肾、肾功能的影响结果显示,模型组肾小管上皮细胞颗粒变性,空泡变性,细胞肿胀,管腔狭窄,甚至闭塞;间质纤维组织增生;肾小球系膜细胞及系膜基质增生。肾络宁及肾炎康复片组肾小管及肾小球的病变明显轻于模型组。见图1、图2。模型组肾小管管腔面积与肾小管面积的比值明显小于正常组(P<0.01);肾络宁组与肾炎康复片组肾小管腔面积与肾小管面积比值明显大于模型组(P<0.01),而肾络宁组又大于肾炎康复片组。提示肾络宁可减轻IgA肾病大鼠肾小管上皮细胞肿胀及管腔缩小,且优于肾炎康复片组。见表2。2.2肾络宁和肾康复片对肝肾上皮细胞的影响正常组肾小管上皮细胞无明显异常,基底膜厚度正常,线粒体清晰,结构正常。模型组肾小管上皮细胞中散在蛋白滴,内质网扩张形成一大空腔、线粒体消失、数量减少、间质可见纤维细胞增生和胶原纤维形成。肾络宁和肾炎康复片组肾小管上皮细胞结构基本正常,一部分线粒体模糊。模型组肾小球系膜细胞及系膜基质增生,并可见电子致密物沉积。肾络宁组与肾炎康复片组系膜细胞无明显增生或轻度增生,无明显电子致密物。见图3～图5。2.3模型复制和复制正常组肾小球系膜区无IgA、IgG沉积;模型组表现为系膜区弥漫性颗粒状IgA沉积,个别呈团块状(见图6),表明模型复制成功。肾络宁组与肾炎康复片组IgA沉积较模型组显著减轻,而肾络宁组又较肾炎康复片轻;IgG沉积相对较少,主要在毛细血管袢处,模型组最重,肾络宁组、肾炎康复片组减轻。3mmp-1表达情况从表3结果显示,肾络宁与肾炎康复片均有降低TGF-β1、Col-Ⅲ、PA1-1、MMP-1、TIMP表达,升高MMP-1表达的作用,与模型组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01);而肾络宁在以上项各表达中均优于肾炎康复片,两者比较有统计学差异(P<0.05)。表明肾络宁能显著降低细胞外基质,降低基质促进因子、基质降解抑制因子,升高基质降解因子的活性,从而减轻IgA大鼠肾小管间质的损害。间质成纤维细胞增殖及相关问题IgA肾病是原发性肾小球疾病中最常见的病理类型之一,约有50%的患者在患病20年后进行性发展至终末期肾衰竭。近年来的深入研究使人们认识到IgA肾病的进行性恶化不仅与肾小球损害有关,更与肾小管间质损害密切相关。肾小管间质损害是大部分炎症和非炎症性肾小球疾病发展的共同最终通路。国内609例IgA肾病患者的临床和病理分析发现,肾小管间质病变可能是决定IgA肾病预后的关键因素之一,但是与肾小球及血管病变程度亦呈平行关系。IgA肾病中的肾小管间质损伤是肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞、成纤维细胞、浸润炎细胞、趋化因子、生长因子、炎症介质多个环节相互作用的综合结果。其中NAG酶、细胞外基质和炎症硬化因子在IgA肾病肾小管间质损害中具有非常重要的作用。本实验参照Emancipator和刘志红的造模方法,以BSA和SEB复合感染的途径制作大鼠IgA肾病模型,造模16周,观察到肾小管间质损害的病理改变:肾小球系膜细胞增生,基质增多;肾小管上皮细胞变性,有蛋白滴沉积,内质网扩张形成一大空腔,线粒体结构消失,数量减少;间质成纤维细胞增生及胶原纤维形成。实验结果还显示模型组肾组织NAG明显升高,肾小管上皮细胞内TGF-β1强表达,小管上皮细胞基底膜及肾间质Ⅲ型胶原表达显著增强,TGF-β1与间质Col-Ⅲ间存在显著相关性,表明TGF-β1的合成增加促进了肾小管上皮细胞及间质成纤维细胞分泌胶原的能力。在肾间质血管平滑肌细胞及浸润的淋巴细胞浆中PAI-1表达明显增多。小管及间质MMP-1表达显著降低,而TIMP-1则呈高表达,这些相关因子的表达变化与大鼠IgA肾病肾小管间质损害的病理变化是相一致的。根据IgA肾病水肿、蛋白尿、血尿等临床表现,属中医水肿、血尿、虚劳等范畴,其发病机制主要为脾肾亏损、气阴两虚、湿热内蕴、瘀血阻络,而少阳三焦气化不利是其中的关键,因此治疗大法以疏利少阳为主,兼益气养阴、清利湿热、活血化瘀,标本兼治多法并用、综合调理。肾络宁是根据中医对IgA肾病的理论认识和临床经验,结合现代药理研究结果而组成的中药复方。该方由柴胡、黄芪、女贞子、白花蛇舌草、山楂等组成。其中柴胡疏利少阳、清解郁热、畅达三焦、枢转气机;黄芪补肺脾之气,女贞子益肝肾之阴,二者相伍补气不过于温燥、滋阴不至于呆腻;白花蛇舌草,清热解毒利湿;山楂入血分活血化瘀。诸药相伍既有整体调节,又有对因治疗,从不同侧面增强或恢复脏腑的气化功能,从而达到控制疾病的目的。现代药理研究表明,柴胡中的有效成分柴胡皂苷具有皮质酮激素样作用,K+、Na+-ATP酶抑制作用,以及抑制血小板活性因子,抑制肾小球内IgA阳性细胞和T细胞浸润,从而产生抗炎、抗凝、调节代谢、调节免疫等作用。黄芪具有利尿、抗氧化、降低血糖,促进蛋白质合成,增加血浆蛋白、抑制高胆固醇血症。女贞子多糖可清除自由基,抑制脂质过氧化,调节免疫功能。白花蛇舌草能够启动T细胞,提高淋巴细胞的转化率,并能刺激网状内皮细胞显著增生,增强吞噬细胞功能,有效地抑制细胞免疫反应的产生,并有增强肾上腺皮质功能作用,此与抑制炎症反应和特异反应有关。山楂具有明显的抗氧化及降低血脂,改善血液流变学的作用,有助于免疫复合物的清除和肾组织病变的修复。本实验应用肾络宁防治IgA肾病大鼠16周,观察到肾络宁可以减轻IgA肾病大鼠血尿、蛋白尿、降低血尿素氮和肌酐水平;降低NAG酶含量,明显减轻IgA肾病大鼠肾小管间质病