嗜热古细菌godna聚合酶基因表达及扩增性能检测

嗜热古细菌godna聚合酶基因表达及扩增性能检测

热能古细菌rgonai是生活在新西兰热流孔中的硫代古细菌。从那里分离提取的tgodna聚合酶也具有很强的耐热性。其蛋白质结构具有5-3聚合酶活性区域、3-5钠胺外切酶活性区域和热适应结构区。氨基酸序列分析表明,TgoDNA聚合酶与Pfu酶的同源性高达82%,其聚合酶活性及3′-5′核酸外切酶活性共同保证了高温复制功能和高保真性。目前的研究大多集中于Taq和Pfu等聚合酶,有关Tgo酶的研究报道较少。本研究从极端嗜热古细菌Thermococcusgorgonarius中克隆了Tgo酶基因,构建高效表达质粒,在大肠杆菌中高效表达和纯化了Tgo酶,并检测了其扩增性能,为基因工程及分子生物学研究提供新型工具酶。1.材料和方法1.1高效表达载体极端嗜热古细菌Thermococcusgorgonarius购自美国ATCC;E.coliBL21Star(DE3)及高效表达载体pET101(使用了强启动子T7,并具有His-Tag靶序列)购自美国Invitrogen公司;保存质粒pUC19的E.coliJM109由吉林大学酶工程实验室提供。1.2酶spe和t4cda连接酶Pfu酶购自Stratagene公司;限制酶SpeⅠ、T4DNA连接酶和dNTP购自日本TaKaRa公司;质粒提取试剂盒和DNA纯化试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司。1.3sgargornus培养将极端嗜热古细菌Thermococcusgorgonarius接种于10ml特制含硫培养基中,充氮气98℃恒温水浴隔夜培养。参照文献方法提取总DNA。1.4pcr扩增条件由于GenBank中无公开的TgoDNA聚合酶基因序列,因此根据Tgo酶蛋白质氨基酸序列设计引物,采用梯度PCR技术,用TurboPfu酶,以提取的Thermococcusgorgonarius总DNA为模板,扩增TgoDNA聚合酶基因。引物序列如下:Tgo-pET101-5′:5′-CACCATGATTCTCGATACCGACTACATCACCGAGG-ACGGGAAGCCCGTGATAAGG-3′;Tgo-pET101-3′:5′-GAAGTCTTTGGCTTCAGCCACGCGCCCAAGCCGAC-CTGTCTTGTCTTCTGGTAGCGCAAATC-3′。引物由美国Invitrogen公司合成。PCR反应条件为:98℃预变性2min;每一循环96℃变性20s,60~53℃退火30s,每一循环降低0.5℃,72℃延伸4min,共15个循环;每一循环96℃变性20s,55℃退火30s,72℃延伸4min,共30个循环;72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,并回收和纯化TgoDNA聚合酶基因,送Genwiz公司测序。1.5蛋白引导蛋白药物代谢将Tgo酶基因克隆入高效表达载体pET101中,构建重组表达质粒pET101-Tgo,经酶切及DNA测序鉴定后转化入E.coliBL21Star(DE3),于LB液体培养基中培养。待菌液A600值达0.6~0.8时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养过夜,离心收集菌体,用裂解缓冲液重悬,经细胞破碎仪破碎、PEI沉淀和亲和柱层析纯化后,洗脱液用KTA缓冲液透析,取样进行10%SDS分析,分光光度计测定蛋白含量。加50%甘油,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性,-80℃保存。1.6pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳从pUC19/E.coliJM109中提取质粒pUC19DNA,以其为模板,用Tgo酶和pfu酶以50μl体系分别进行PCR扩增,并进行琼脂糖凝胶电泳分析。采用改进的Kunkel法,以完整质粒pUC19基因(含β-半乳糖甘酶基因)为模板进行PCR扩增,蓝白试验比较Tgo酶与Pfu酶的扩增忠实性。2.结果2.1tgo基因tgo分析PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见约2300bp的TgoDNA聚合酶基因条带,大小与预期相符,见图1。根据测序获得的基因序列推导出的酶蛋白氨基酸序列,与GenBank中公布的氨基酸序列一致,表明分离的基因是Tgo酶基因。见图2和图3。2.2相对分子质量分析表达的TgoDNA聚合酶为可溶性蛋白,经10%SDS分析,其相对分子质量约为89000,大小与理论值(88800)相符,见图4。表达量为350μg/gE.coli,50%甘油保存的Tgo酶活性约为5U/μl。2.3tgo酶和p装置的扩增效果以质粒pUC19为模板,用Tgo和pfuDNA聚合酶进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见2890bp的质粒pUC19基因条带,见图5,表明Tgo酶具有良好的扩增性能,在延伸时间和循环次数相同的情况下,Tgo酶与pfu酶的扩增产出率相当。蓝白试验结果显示,Tgo酶93653个菌落中白斑159个,占菌落总数的0.17%;Pfu酶86163个菌落中白斑164个,占菌落总数的0.19%。见表1。表明Tgo酶的PCR扩增忠实性与Pfu酶相当。3.去除目前存在的基因,增加了其它菌株的表达虽然已有对TgoDNA聚合酶的研究,但仅有公开的蛋白质序列,而GenBank中未见其DNA序列报道。从本文克隆的Tgo酶DNA序列推测的蛋白质氨基酸序列表明,克隆的基因是TgoDNA聚合酶基因。耐热酶基因在嗜热菌中的表达水平极低,酶的纯化过程繁琐,尤其是嗜热微生物作表达宿主,目前还缺乏有效的基因转移体系,上述因素对嗜热菌作表达菌起到了一定的限制作用。因此,研究者尝试将编码耐热酶的基因在异源常温宿主菌如大肠杆菌中表达,通过热变性的方法除去宿主蛋白(非热稳定蛋白)而进行纯化。目前,只有少数嗜热微生物基因在大肠杆菌等常温菌中表达成功,但表达效率不高,一般在10~50μg/gE.coli。本文构建的高效表达质粒pET101-Tgo中,使用了强启动子T7,同时新型E.colBL21Star(DE3)菌株含有多个大肠杆菌argU、ileY和leuW的tRNA基因拷贝和RNE131突变,均可增强E.coliBL21Star(DE3)的表达能力,因此,允许高效表达在一般寄主中难以表达的外源基因,使该表达体系具有非常高的表达效率。另外,表达质粒pET101-Tgo中的His-Tag靶序列易于基因表达产物的纯化。本实验构建的耐热菌酶高效表达质粒亦可用于其他耐热菌酶的表达和纯化。由于Kunkel等的方法实验过程较为繁琐,因此,本实验以完整的质粒pUC19基因(含β-半乳糖甘酶基因)为模板进行