胞外钙离子信号的研究进展

胞外钙离子信号的研究进展

从动物到植物，从植物到昆虫，它们都发掘出独特的物理和化学属性，并完成基本的生物学功能。单细胞原始的生命形式在探测胞外营养物质和离子(如Ca2+)方面明显具有优势,因为它能够运动,使生物体选择最适合它们生存的最佳方位。随着多细胞生物的出现,生物体需要调整局部胞外环境的组分,正如复杂的生物体对控制身体里循环流动的Ca2+有着精确的调节机制。Ca2+的一些特性(包括离子半径、水势、不规则几何形状等)允许它们相互作用,并且可逆地绑定在胞内靶蛋白上。因此,人们普遍认为Ca2+在胞内信号转导及生物有机体结构组成方面起着不可缺少的作用。许多生物有机体也表达着Ca2+细胞表面受体。这当中的蛋白最初可能只是进化为一般的营养物质和矿物质离子的传感器的一部分,随着时间的发展,在多细胞宿主中,逐渐获得一些新的功能。尤其是细胞可能已经找到一些新的途径去利用这些蛋白,来延伸高度通用的Ca2+信号到一个新的范围:细胞外。目前人们对胞外Ca2+的兴趣已经远远超过对胞内Ca2+第二信使功能的关注,这源于胞内Ca2+指示剂的发展。从19世纪60年代开始,人们就已经使用Ca2+敏感的水母发光蛋白。后来的发展包括引入了荧光小分子指示剂,如fura-2-AM和fluo-3AM,以及绿色荧光蛋白为基础的指示剂,定位在不连续的细胞区,允许对Ca2+在特定的亚细胞组分和微小区域进行度量。1动物细胞中的ca2传感器1.1胞内ca2+信号传递在人类以及其他动物中,副甲状腺、骨骼、肾脏系统、肠都在协同作用平衡体内摄入、排泄、及再循环的Ca2+。当血清中[Ca2+]降低,会导致副甲状腺激素(PTH)分泌。PTH分泌的主要结果是通过肾脏和加强肠的Ca2+摄入使Ca2+浓度维持不变。另外PTH持续增长,导致骨骼Ca2+的网络状释放。所有这些系统都集中到使血清[Ca2+]回到它正常基本水平。在这种独特的平衡机制的监控下,正常个体血液中的[Ca2+]保持着十分稳定的水平(~1.4mmol/L)。尽管血清中的[Ca2+]基本保持不变,但人们还是可以观察到,在缝隙流动的少量细胞局部会产生波动。有人证明这种波动经常发生在胞内Ca2+信号事件中。事实上,在荧光指示剂发展起来以前,许多传统的生理实验通过测量组织和器官中45Ca2+的流量就已经对激素引起的Ca2+信号进行研究。最初的一些数据表明,通过兴奋剂刺激观察到阳离子在胞外有明显的损耗或积累,证明激素或神经传递素能够引起胞内Ca2+信号传递。在细胞质Ca2+信号传递过程中,由于通过质膜Ca2+的输出(比如质膜Ca2+ATP酶,PMCA)和输入(存储操控通道SOCs)活性,使细胞成为主要的钙源和钙接收器。尽管这两个过程最终达到平衡,也就是说在信号终止后细胞的Ca2+恢复到不变的水平,但在此过程中还是会产生胞外Ca2+瞬时浓度梯度。无论如何,Ca2+流入和流出都有时间和空间上的分隔。例如Caroppo等使用Ca2+选择性微电极进入胃上皮细胞和胃腺内腔的空隙中,直接测量到通过类胆碱激活剂刺激胞外Ca2+,间接引起了胞内Ca2+峰值。由于在那些细胞中Ca2+输入和输出呈极化分布,因此在胃腺有限的鲁米诺(一种镇静剂)区域,记录到瞬时的[Ca2+]升高0.5mmol/L,然而在细胞侧基检测到类似的[Ca2+]降低。在用葡萄糖刺激胰岛细胞后使用微电极测量胞外[Ca2+],发现大范围[Ca2+]降低(~0.5mmol/L)在胰岛细胞内区域也有发生。1.2bopcar扩增在CaR分子鉴定之前人们就已经预测到在甲状旁腺细胞中有Ca2+受体。离体甲状旁腺细胞中胞外[Ca2+]升高(或其他已知CaR激活剂如多聚阳离子Gd3+进行处理)引起胞内Ca2+信号。这一现象在当时看来几乎不可能,后来进一步研究证实这个反应是由磷脂酶C(PLC)/1,4,5-三磷酸肌醇(InsP3)/Ca2+信号途径的刺激引起的。几年后,在牛甲状旁腺中应用表达克隆的方法,克隆出一个5.3kb的基因——BoPCaR,表达蛋白是一个G-耦联蛋白,有7个跨膜结构域,由1,085个氨基酸组成,对胞外Ca2+,新霉素,Gd3+以及其他多聚阳离子激活剂敏感。更令人惊奇的是后来发现CaR在许多物种多种细胞类型的许多细胞表面表达。自从BoPCaR克隆后,人们预测在肾脏、甲状腺、脑中可能有类似的受体。从那时起,CaR就被定位在多种多样类型的细胞中,但是许多与维持身体内Ca2+平衡的功能并没有关系。在不平衡系统中CaR的重要功能已经引起相当大的科学性趣,但到目前为止,没有一个统一的假说来说明在这些细胞中CaR的存在方式以及在何时、这些受体又是如何变得具有生理活性的。1.3gpcrs家族尽管有超过800个具有7个跨膜结构域的细胞表面受体已经被鉴定(或假定存在),但至今为止只有一个异三聚体G-蛋白耦联受体(GPCR)的晶体结构被完全解析,那是一个视网膜色素。但是同型二聚体代谢型谷氨酸盐I型受体(METABOTROPICglutamatereceptortypeI,mGluR1)的胞外区域(ECD)的晶体结构已经解决,发现mGluR1ECD与CaRECD极其相似。CaR的一个特点是它具有一个格外大的氨基酸末端胞外区域(大概600个氨基酸),这是所有的CGPCRs家族所共有的特征,CaR也具备。除代谢型谷氨酸盐受体外,这个家族也包括γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric-acid(GABA)B)受体。值得注意的是,mGluRl和GABAB具有感受胞外Ca2+的能力,而CaR能感受氨基酸,尽管对于mGluRl在功能上是否相当于Ca2+的传感器还有争议,但胞外[Ca2+]的变化确实能改变受体活性。同一家族的其他典型成员,CaR在构成上常常通过共价和非共价连接形成二聚体,这对于它正常的功能是十分重要的。CaR被蛋白激酶C(PKC)的磷酸化作用所调控,每个单体包括5个假定的PKC磷酸化位点,也包括两个潜在的蛋白激酶A(PKA)调控位点,目前对它们的生理相关性还不是很清楚。这个受体定位在细胞膜穴样内陷并且绑定在支架蛋白氧化膜上,与CaR通过分裂素激活蛋白激酶(MAPK)级联信号相关联。另一个值得注意的结构特征是在胞外区富含半胱氨酸,这对于将信号传递到7个跨膜结构域是至关重要的。在胞外氨基酸末端的116位丙氨酸和136位脯氨酸之间的区域,对维持受体无活性构象是至关重要的,这个区域与人的受体自然发生活性突变相关联。尽管这个特异性的参与Ca2+介导活性的残基目前还没有精确定位,但已经证明这个残基绑定在胞外区域。从表面上看,Ca2+单独作用时似乎对CaR不是一个有效的激活剂,然而Ca2+绑定在CaR上使CaR成为一个对Ca2+增量/减量敏感的探测器。受体二聚体构型对这个性质也有作用。因此CaR能够非常容易地识别胞外[Ca2+]的微小波动(约200µmol/L),说明CaR具有精确调控血清Ca2+的能力。这个调控是通过分泌副甲状腺激素(PTH)反馈机制以及其他Ca2+平衡系统来实现的。1.4胞外ca2+表达长时间暴露在激活剂中,大多数细胞表面受体变得不敏感,这能够防止对细胞的过多刺激。但CaR长期受到刺激(比如Ca2+,Mg2+和氨基酸),它的敏感性降低却很慢。通过Ca2+信号途径延长CaR信号时间,那么这些细胞又是如何避免长期的细胞质[Ca2+]升高带来的毒害作用呢?一个解决的办法就是通过Ca2+信号振荡的模式转换这些信息。事实上,副甲状腺细胞中细胞质Ca2+水平在CaR活化剂的刺激下,很强烈地振荡,与CaR感染HEK293细胞、羊甲状腺滤泡细胞、和胰腺泡细胞的Ca2+水平类似。可能是一些机制共同作用来加强CaR表达细胞中Ca2+振荡,包括Ca2+反馈机制即在Ca2+峰值之后Ca2+从细胞中流出及其他PKC依赖的反馈机制。最近Young和Rozengurt研究表明,CaR表达细胞中不同的氨基酸刺激不同的Ca2+信号振荡模式,胞外Ca2+能够引起不同的应答模式。因此可以通过振荡反应的频率和振幅进一步编码胞外Ca2+信号。1.5调控因子的影响尽管CaR对Ca2+的敏感性可能不是最显著的,但我们应该知道CaR暴露在多种生理激活剂(如Mg2+,多胺,氨基酸)以及病理的激活剂(如抗生素、重金属、β淀粉链)联合作用下。另外CaR对离子强度的改变和胞外pH非常敏感。降低盐浓度、升高pH能够增加受体活性。因此,许多CaR调控因子是使受体对胞外[Ca2+]的增量变化更敏感,并且这种作用通过CaR活化作用协作进一步加强。尽管普遍认为Ca2+是CaR的主要生理激活剂,但不能排除还有其他的高度特异的CaR内源配基没有鉴定出来。目前已知的CaR的调控因子包括:多价阳离子的催化、三价和二价金属离子、抗生素、变构催化剂以及CaR抑制剂。在许多类型细胞中,CaR能够调节多种细胞过程,比如分泌、趋化现象、细胞死亡、增殖、异化、以及离子通道活性等。与许多细胞表面受体类似,CaR与激活剂绑定在一起,使细胞内形成一个复杂的分支的细胞信号网络,允许一个单独的胞外信使信号来指导众多的胞内功能(图1)。然而,也和其他细胞表面受体一样,目前对于这样一个单独的受体(CaR)依赖细胞环境在其中表达,如何能够产生那么多的生物信号终点(如细胞死亡、分化、增殖、以及分泌)还知之甚少。CaR指导多种细胞功能的特异性细胞信号转导机制的阐述在未来无疑是一个富有成效的研究领域。2胞外ca2+与动物细胞类似,胞内Ca2+在植物中也是一个重要的第二信使。植物细胞利用复合信号比如Ca2+振荡来指导特殊的细胞行为。植物中人们通过保卫细胞的研究已经证实胞外Ca2+作为胞外信使的功能可以将胞外Ca2+变化与胞内Ca2+特异性变化联系起来,但至今有关机理研究得还不是很清楚。最近Han等阐述了一个新发现的胞外细胞表面受体,并且确定了Ca2+在植物中第一信使的位置。叶片表皮一对保卫细胞形成气孔,水分和气体在这里发生交换。非原生质体中的调控因子通过改变保卫细胞的膨胀压来调节气孔的大小,这些调控因子包括植物激素ABA、CO2,生长素以及胞外[Ca2+]的升高。而胞内Ca2+是调节气孔开闭信号网络中一个重要的组分。通过对Commelinacommunis离体叶片表皮保卫细胞的研究证实胞外Ca2+升高引起胞内Ca2+的升高。当胞外[Ca2+]从0.01mmol/L升高到0.1mmol/L,在几分钟时间内就可以引起胞内[Ca2+]不断上升。一系列实验证据表明[Ca2+]升高确实能编码特异性信息。比如ABA作用之后表现出Ca2+的升高,并且不同的Ca2+振荡模式能够引起不同的气孔关闭反应。Arabidopsisdet-3突变体对由于胞外[Ca2+]升高而产生Ca2+振荡增加的反应应答有缺陷,即使增加胞外[Ca2+]也不引起气孔关闭,但是它对ABA刺激能做出正常的反应。另外一个拟南芥突变体gca2,表现出胞外[Ca2+]升高和ABA刺激之后,Ca2+振荡模式的改变,也发现它在胞外[Ca2+]升高之后气孔关闭有缺陷。这些工作有力地证明了保卫细胞细胞质[Ca2+]升高频率能够编码特异性信号从而决定气孔开闭。胞内[Ca2+]振荡上升的模式与胞外Ca2+不同。这个重要的现象引起人们的思索。人们推测植物可能与动物细胞细胞质Ca2+振荡具有相同的途径来编码刺激特异性信号分子。胞外Ca2+升高可能简单地促进Ca2+内流并引起胞质[Ca2+]升高。由于Ca2+流出与流入相比要延迟因此能够使细胞质[Ca2+]升高,表现出细胞质Ca2+平衡机制被扰乱。以上实验证明,Ca2+受体存在于细胞表面,并且将胞外Ca2+信号传递到细胞内。最近,在植物中胞外钙受体的分子鉴定方面取得了决定性进展。Han等最近证明植物中胞外Ca2+确实具有生理信号的作用,激活细胞表面受体特异性地引起胞内Ca2+升高,与鸭跖草中的结果类似。采用表达克隆的方法,在动物细胞HEK239中表达拟南芥叶片cDNA文库并筛选胞外Ca2+诱导的胞内Ca2+升高的克隆,成功地克隆了一个钙敏感受体。这个小组鉴定到一个387个氨基酸残基的拟南芥质膜蛋白—CAS。CAS蛋白与动物中的G-蛋白耦联受体家族中的Ca2+受体在序列上没有同源性,但CAS能够耦连哺乳动物宿主细胞内磷酸肌醇/Ca2+信号途径(植物中CAS很显然也是通过同样的途径升高胞内[Ca2+])。CAS跨膜一次,与CaR和其他G-蛋白耦连受体典型的7个跨膜结构域不同。由此,人们推测在胞内羧基末端硫氰酸酶类似的序列在功能上可能参与蛋白质之间的相互作用;并推测胞外氨基酸末端有几个酸性残基,可能是Ca2+低亲和的结合位点。CAS主要在叶片、茎、花以及表皮保卫细胞中表达。在洋葱表皮细胞和拟南芥保卫细胞中组成型表达35s::CAS–GFP,融合基因蛋白产物定位在细胞表面。组成型表达反义载体降低CAS的表达,导致明显的胞外Ca2+-诱导胞内Ca2+升高作用的破坏。有趣的是ABA诱导的气孔关闭在反义植株中没有受到影响,表明ABA诱导的细胞质Ca2+波动还有另外的途径调控。然而ABA与胞外Ca2+-诱导胞内Ca2+波动的模式大体上相似,表明它们可能在受体下游有类似的调控机制。ABA诱导的胞质Ca2+升高在CAS反义植株中是否受到影响将是一个有趣的课题。Han等提供了初步的证据证明细胞质Ca2+的升高是通过产生IP3从细胞内库中释放Ca2+,然而这与McAinsh等人早期的工作不相符。McAinsh等认为胞外Ca2+-诱导胞内Ca2+升高不需要磷脂酶C,但涉及到Ca2+流入。Han等认为蒸腾率对Ca2+传递到保卫细胞气孔的传递效率是一个重要的影响因子。高的蒸腾率和气孔蒸发将导致胞质Ca2+增加,导致气孔关闭并随之降低胞外Ca2+,提出了一个胞外Ca2+调控的反馈机制。这个观点意味着气孔对它自身的胞外Ca2+是一个主要的调控因子。然而可能是叶片中其他细胞对细胞外Ca2+进行控制,木质部体液中只有毫摩尔范围的的Ca2+被运送到叶片非原生质体中(图2)。胞外Ca2+升高到0.01mmol/L保卫细胞就要关闭,因此一定存在着降低保卫细胞周围非原生质体Ca2+浓度的机制。Ruiz和Mansfield报道鸭跖草保卫细胞周围的附属细胞通过吸收Ca2+并将它急剧降低为液泡中的草酸钙来执行这个功能。钙生植物,生长的土壤含有高浓度的Ca2+,木质部体液中Ca2+浓度会达到更高。有一个很好的证据证明,在这些植物中,叶肉细胞与特异的表皮细胞一起作用对排除非原生质体Ca2+具有重要作用。今后阐述CAS下游信号转导途径、它与其他蛋白和信号传递途径(如Ca2+转导途径、ABA信号)之间的相互作用将是非常有趣的课题。非原生质体Ca2+的成像技术对于今后研究植物非原生质体Ca2+作为普遍的胞外第一信使的功能是必须的。由于CAS在动物细胞中表达至少具有部分功能,人们推测Ca2+信号转导机制在植物和动物之间有一定的保守性,它可能与Ca2+信号转导机制中的组分相互作用。动物细胞中的胞外Ca2+执行着一定范围内信号功能,包括Ca2+平衡、激素分泌的调控、细胞程序死亡、细胞增殖。因此CAS以及非原生质体Ca2+可能要执行一定范围的功能,包括植物生理、发育以及表型。与CaR类似,对CAS的分子鉴定将促进植物中胞外Ca2+生理作用的进一步研究。3胞外ca2+受体信号检测Ca2+是一种最简单的信使,因为它不需要化学合成和修饰,并且是最为通用的信使,因为它在胞内胞外的许多位点发挥着功效。生物信号系统至少有三个基本元素组成:信号、受体以及连接信号和受体之间的途径。在完整组织中胞外[Ca2+]发生动力学变化(信号),以及细胞表面蛋白的稳定表达,检测出那些波动(受体),提示我们利用胞