股骨颈骨折后股骨头内骨细胞凋亡及bcl-2表达的关系

股骨颈骨折后股骨头内骨细胞凋亡及bcl-2表达的关系

股骨颈骨折是一种常见的骨损伤。主要并发症是骨折不全和股骨头坏死，其中股骨头坏死风险高。笔者运用免疫组化技术对股骨颈骨折患者30d以内股骨头标本分组进行Bcl-2检测,并进行组织形态学观察,同时采用原位末端标记(TUNEL)法检测骨细胞的凋亡情况,探讨股骨颈骨折后股骨头内骨细胞凋亡对股骨头坏死的影响及其病理机制。1临床数据和方法1.1骨折时间和性别分布患者共60例,其中男19例,女41例;年龄50～70岁,平均65.7岁。排除肿瘤性疾病和长期卧床患者。骨折均为外伤所致,均在骨折后30d以内。据骨折时间长短分为早、中、晚期组:早期组(3～10d),男5例,女15例;中期组(10～20d),男8例,女12例;晚期组(20～30d),男6例,女14例。1.2空骨陷窝所占比例的确定股骨头负重区沿冠状面剖开,冠状面切取2mm厚组织做石蜡切片,用40g/L多聚甲醛(pH=7.2),100g/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)Tris-HCl脱钙,多聚赖氨酸处理玻片做HE染色,切片上随机计数100个骨细胞计算空骨陷窝所占百分比。1.3抗人单克隆抗体标本5μm石蜡切片,多聚赖氨酸处理玻片做PV-9000免疫组化染色,具体步骤参照试剂盒说明进行。Bcl-2鼠抗人单克隆抗体及PV-9000试剂盒均为北京中山公司产品。用已知阳性切片作为阳性对照,用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。二甲基联苯胺(DAB)染色,苏木素对比染色。Bcl-2表现为细胞浆阳性。判断标准:阳性细胞表达数<1%为阴性(-),1%～5%为(+),6%～25%为(++),≥25%为(+++)。1.4阳性细胞的检测采用TUNEL法,试剂盒购自北京中山公司,实验步骤参照说明书。试验设阳性与阴性对照,当胞核出现黄色颗粒为阳性细胞(即凋亡细胞)。结果观察:每张玻片随机选择10个区域,每个区域计数50个骨细胞,统计出凋亡细胞数,即为每500个细胞中的细胞凋亡数。1.5患者股骨空骨陷窝计数及凋亡细胞计数采用SPSS10.0统计软件包进行数据处理,不同组别股骨头空骨陷窝计数及凋亡细胞计数以x¯±sx¯±s表示,采用t检验;免疫组化染色表达采用等级分组资料H检验。2结果2.1骨细胞消失或凋亡各组股骨头外观正常。早期组大部分股骨头软骨下呈缺血坏死改变,髓腔内各种细胞消失,大部分骨细胞胞核消失,骨陷窝空虚,仍可见部分残存的骨细胞,骨小梁形态大致正常。中期组骨细胞绝大部分胞核消失,骨陷窝空虚化,骨小梁部分吸收,可见少量新生血管。晚期组骨细胞胞核均消失,仅见空骨陷窝(图1),部分骨小梁边缘可见成骨细胞及新生血管。在不同组中均可见到凋亡的骨细胞,其特征是核固缩、染色质深染浓集、核碎裂,形成凋亡小体(图2)。不同时间股骨头骨细胞空骨陷窝计数结果见表1。2.2免疫组化的结果Bcl-2在各组标本中均见表达,但以中期组表达明显(图3),结果见表2。TUNEL法检测凋亡细胞结果见图4、表3。3骨髓松茸与细胞凋亡股骨颈骨折是一种常见的骨损伤,其主要的并发症是骨折不愈合和股骨头坏死。由于现代股骨颈骨折复位固定技术的进展,骨折不愈合率已明显降低,而股骨头坏死率仍然很高。细胞凋亡是细胞死亡的两种方式之一。它与细胞坏死不同,具有特征性的形态改变和生化改变。老年人股骨颈骨折与骨质疏松有关,而骨质疏松本身与骨内细胞凋亡又有着密切联系,骨内细胞包括成骨细胞、破骨细胞和骨细胞。近年来研究表明,骨质疏松发生的骨内细胞凋亡主要发生在成骨细胞,而骨细胞凋亡发生率较低。因此,笔者观察主要集中在骨细胞凋亡方面。细胞凋亡受多种基因调控,在哺乳动物中bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控中起重要作用,可以增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性,抑制细胞凋亡,是一种凋亡抑制基因,有人称之为长寿基因。3.1骨细胞凋亡的表现本研究标本均为股骨颈骨折后30d以内,组织学观察有不同程度的空骨陷窝形成,意味着出现了骨细胞的死亡,并随着时间的发展而加重。在不同组中均可见到凋亡的骨细胞,其特征是核固缩,染色质深染浓集,核碎裂,形成凋亡小体。Dunstan等发现,部分骨细胞在骨陷窝中消失的现象可以增加老年髋部骨折个体股骨头内骨小梁数量,推测可能与骨细胞凋亡有关。TUNEL法测定细胞凋亡也表明,中期组细胞凋亡较晚期组少。随着骨折后时间延长,晚期组出现不同程度的修复。在此过程中既有骨细胞凋亡所致骨吸收,又有成骨细胞增生致新骨形成。近年来的研究表明,骨细胞具有感受并传递骨组织应力信号的功能,这种应力信号可以通过骨细胞传递给破骨细胞,使破骨细胞将不再接受应力部位的骨细胞清除,骨细胞中的一部分是经历凋亡后被破骨细胞吞噬清除的。另外,骨细胞还可以传递骨损伤表面的信号,使破骨细胞清除损伤骨细胞。而骨内骨细胞的死亡或凋亡可以产生针对破骨细胞的传递信号,使破骨细胞清除损伤区域的骨组织,否则作为骨细胞和破骨细胞联系信号中断的结果,将导致骨坏死区域累积,增加骨折危险性。3.2骨细胞增殖和凋亡细胞凋亡的各种信号转导途径都有一个共同的通路或交汇点,而该共同通路或交汇点受Bcl-2调节。实验表明,Bcl-2可以增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性,抑制细胞凋亡,但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损伤,同样也不能促进DNA修复。Bcl-2基因在各种正常细胞的激发和发育过程中可以有表达,而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。Bcl-2免疫组化染色表明,早期组及晚期组表达均较中期组弱,差异有显著性意义(P<0.05)。其可能机制是在早期组由于股骨颈骨折导致血供受阻而引起大量骨细胞缺血坏死及凋亡;中期组由于血供的部分恢复,形成类似缺血再灌注损伤,产生大量的氧自由基和过氧化物,从而通过分子途径激活Bcl-2基因表达来抑制细胞凋亡。骨组织作为一种不断重建的组织,其数量很大程度上取决于构成该组织的活性细胞数量。构成骨组织的细胞主要包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等,其中骨细胞的数量及活性对于骨量的维持起着重要作用。骨细胞的确切作用目前还不十分清楚,有证据显示,骨细胞能对机械载荷的刺激产生反应,推测骨细胞可能是骨基质中的应力刺激受体传感器,感应骨组织上的载荷大小和方向变化,并把信息传导到骨形成和吸收相关的细胞,引起骨结构的再建和修复。Noble等研究发现,成人病理性骨组织和婴儿颅骨中有大量骨细胞出现细胞凋亡,而在成人正常皮质骨中,凋亡的细胞很少发现,骨细胞的出现可以抑制破骨细胞的破骨功能,与骨转换有明显关系。因此,他们认为,病理骨组织较高的转换率可以引发骨细胞的快速凋亡。司晓辉等认为,骨折愈合时细胞增殖和凋亡同时发生,在骨折愈合的膜内成骨期,此时骨折端附近的细胞处于去分化状态,增殖明显。在细胞去分化达到高峰期时,细胞凋亡也达到最多,而在细胞分化和成熟期时凋亡细胞数量也减少。这说明细胞增殖和凋亡这两个过程是协调发展的。在高转换率骨组织中,骨细胞被破骨细胞清除,所以,骨细胞凋亡与骨组织生长、代谢和