竹类超微结构的超细切片制备方法

竹类超微结构的超细切片制备方法

竹是我国森林资源的重要组成部分。它不仅具有很高的经济效益，而且具有很高的社会和生态效应。现在，各地都在大力发展竹种丰富的林。因此，竹超微结构的研究对于提高竹种生产的科技水平具有重要意义。然而，在研究竹类超微结构时，很难制作完整的碎片。到目前为止，还没有发现竹叶的透射电视照片。我们多次使用超膜剂的制备方法，但没有成功。这不是碎片的破裂，而是细胞结构的模糊。氢氟酸可以软化和处理，虽然可以制作出理想的片剂，但除了细胞之外，其他结构的模糊性无法观察和分析，因此无法进行研究。结果表明，超段的成功制备对于超微结构的研究非常重要。经过几次实验，我们成功地获得了一种理想的竹片超声切分法，并将竹片超微结构研究提高到了一个新水平。1试验材料分别取福建林学院内的凤尾竹叶、杆、林学院后山的毛竹叶、福建顺昌的黄甜竹叶、福建尤溪的毛环竹叶为试验样品.样品均为当年生.2测试方法2.1磷酸缓冲液配制单次清洗酸取上述4种不同竹叶,用一般木本植物超薄切片的制备方法,分别将它切成0.5mm2×4mm的细长条,立即放入用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)配制的5%戊二醛中,并用真空泵进行抽气使之下沉,固定24h,用磷酸缓冲液清洗3次(每次20min),再经0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)配制的2%的锇酸固定7h后,仍用磷酸缓冲液清洗3次(每次20min,);接着用乙醇逐级脱水(30%→50%→70%→80%→90%→100%2次)(每次20min),70%乙醇脱水之前的实验均在0～4℃下进行,80%以后均在室温下进行.脱水后用环氧丙烷过渡2次(每次20min),然后用环氧丙烷∶包埋剂(Epon812环氧树脂)(1∶1)浸透9h,(1∶3)浸透12h,100%包埋剂中浸透24h,最后用Epon812包埋剂进行包埋,并分别在37℃、45℃、60℃温度下各聚合24h.取出后在LKB-Nova型超薄切片机上用玻璃刀进行切片,并经醋酸铀、柠檬酸铅双染后在JEM-100-CXⅡ型透射电镜下进行观察及拍照.2.2电镜观察和照片观察取同一种凤尾竹的叶、杆分别用6种不同的固定前软化处理:A、高压锅水煮5h,B、水煮10h,C、氢氟酸处理12h,D、水煮5h+氢氟酸处理12h,E、水煮10h+氢氟酸处理12h,F、高压锅水煮5h+氢氟酸处理12h,前处理后都按第1组实验的制备方法进行,最后进行电镜观察及拍照.2.3氢氟酸软化处理时间的确定取同一种毛竹叶片采用第组实验中的制备方法在双固定清洗后增加了氢氟酸软化处理处理时间分别为1h、2h、3h、4h、8h5种,其余的仍按第1组实验的方法进行,最后电镜观察及拍照.2.4环氧丙烷-包埋剂混合物的铺设方法取凤尾竹、毛竹、黄甜竹、毛环竹4种不同的叶片,用同一种制备方法,所不同的是根据竹类叶片特殊的细胞结构以及生物学特性,在第1组实验方法的基础上进行了适当的调整.主要是改变了固定液的浓度,逐级浸透的梯度、浓度,以及适当延长了固定、浸透、脱水的时间.具体改进的方法是:将戊二醛浓度改为2.5%,锇酸的浓度改为1%其固定时间改为9h,100%乙醇脱水时间改为每次30min,改变了(环氧丙烷:包埋剂)混合物浸透的起始梯度以及增加梯度系列,即(3∶1)浸透3h、(2∶1)浸透3h、(1∶1)浸透8h、(1∶3)浸透16h、100%包埋剂中浸透50h并放在30℃的温箱中,其它制备过程均与第1组实验相同.最后进行电镜观察及拍照.该实验曾重复做过4次.3细胞结构的变化根据超薄切片及电镜观察结果,第1组实验中的每种样品都没有得到良好的固定和浸透,切片破碎,个别能切成片的,结构也是模糊不清,如图1所示.第3组实验结果,与第2组实验中的叶片情况相似,每种处理的样品都得到了良好的浸透,切片完整,连续成带,其厚度为50～70nm左右,呈银白色.经氢氟酸处理1h后的样品细胞结构虽然没有聚集一起,但除了细胞壁以外其它结构也是模糊不清的,仅比第2实验组中的C处理结果好点,如图1所示.其它4个样品,处理的时间越长细胞破坏就越严重.8h的结果与C处理情况一致.第4组实验结果,4种竹叶都得到了完全的浸透,切片连续成带,厚度为50～70nm左右,呈银白色,电镜观察结果:毛竹叶片的细胞超微结构保存良好,精细结构完整清晰如叶绿体中的片层结构、还有线粒体、微体、糖原颗粒等都可清楚地观察到,凤尾竹中线粒体的内脊、糖原颗粒等都可清楚地观察到但叶绿体的片层不清晰毛环竹也能观察到叶绿体及糖原颗粒线粒体等结构但叶绿体片层及线粒体内脊都不清晰;而黄甜竹只能观察到细胞壁及有些模糊的叶绿体形状,而片层就更不清楚,其余细胞结构均未见到,如图1所示.4种叶片观察结果最好的是毛竹其次是凤尾竹、毛环竹最差的是黄甜竹.现将几种不同的实验结果列表如下:4不同种类竹类叶片的显微组织第1组实验采用一般木本植物超薄切片的制备方法,结果切片破碎,结构模糊不清,其原因是竹类植物与一般木本植物在结构和生物学特性上存在很大的差异,它除了具有一般木本植物那样有厚的细胞壁、胞间隙、液泡等疏水性结构以外,还有蜡质层、表皮毛、硅细胞、石细胞、栓细胞这些细胞的壁极度加厚使得它变得坚硬而粗糙.因此,使竹子叶片对固定液、包埋剂以及各种溶剂的渗透力显得极弱,从而得不到良好的固定和浸透.以致造成切片破碎,结构模糊.第2、3组的实验结果表明,经氢氟酸或水煮软化处理后虽促进了样品对包埋剂的浸透,改善了切片的性能,但细胞超微结构却遭到不同程度的破坏,经过1h短时间的氢氟酸或5h水煮软化处理,其细胞超微结构都会受到很大的破坏.对于竹茎即使采用长时间(12h)的软化处理都无法进行超薄切片,说明竹杆和竹叶在结构和生物学特性上差别很大.因此这些方法只适用于研究竹类叶片细胞壁的超微结构,对于竹杆只能用于研究它的显微结构.第4组实验结果表明,用同一种方法制备不同种类的竹子叶片所得到的结果有很大的差别,毛竹的结果是最理想的,而其它3种竹叶都有一个共同的特点,叶绿体片层不清楚.我们知道片层主要是由双层膜构成的,膜的主要成分是蛋白质、脂类、核酸等,其中蛋白质占30%～50%,脂类占20%～30%,在双固定中蛋白质、脂类、核蛋白主要靠锇酸来固定,而糖原、核酸主要是由戊二醛来固定,由于锇酸的渗透性很差,再加上竹叶所具特殊构造使锇酸的渗透性就更差,可见片层结构模糊的原因是由于锇酸固定不好所造成的.而黄甜竹中连糖原等内含物都没有,说明它在戊二醛中也没得到良好的固定,因此对这3种竹叶的锇酸固定时间可再适当延长些,黄甜竹对戊二醛固定的时间也可再适当延长.综上所述,在细胞结构和生物学特性上,不同植物有很大的差异,同一植物不同器官同样有很大的区别,即使是同一种类的植物叶片自然类型以及叶龄的不同,生物学特征也不尽相同.因此固定液和包埋剂的浸透力也将随之产生变化,可见对它们的处理过程并不能完全生搬硬套,还须根据各自的生物学特性在上述制备方法的基础上适当的改进实验方案才能获得理想的结果对竹类样品适当减小固定液的浓度及增加包埋剂逐级浸透的系列,适当延长固定、浸透、脱水的时间.这都是很有必要的.但必须注意各种溶剂处理的时间太长也会引起物质的抽提,或影响切片性能.上述第1组实验方法对任何竹类叶片都是不适合的.第2、3组实验只适用于竹类叶片细胞壁的超微结构研究,而且软化处理时间最好在1h以内.对于竹茎还须延长软化、各种溶剂处理的时间以及调整包埋剂逐级浸透的系列第组实验的制备方法对毛竹叶片的制备较理想。第2组实验结果,每种处理的叶片都得到了良好的浸透,切片完整,连续成带其厚度为50～70nm左右,呈银白色.经氢氟酸处理的样品比单用水煮的切片性能更好些,但电镜观察结果,每种处理的细胞结构都遭到严重的破坏和抽提;高压锅水煮5h的样品,除细胞壁及残存几个破碎的叶绿体以外其它结构都丢失了