第三章-基因克隆2

第三章基因工程载体第二节

噬菌体载体噬菌体的一般生物学问题1噬菌体:细菌病毒的总称结构上有很大的差别，一般可归纳为三种基本类型：无尾的二十面体型、有尾的二十面体型和线状体型，多数为第二种。

噬菌体的核酸，最常见的是双链线性DNA。除此之外，还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差可达上百倍。情况往往是，具有大分子量核酸的噬菌体，其生命周期就比较复杂，而且在它们的复制过程中，对于寄主细胞酶分子的依赖性也较低。有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。例如，T4噬菌体DNA中就没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶(HMC);SPOl噬菌体DNA中没有T碱基，代之以5-羟甲基尿嘧啶(HMU)。

噬菌体的感染效率高到令人生畏的地步。一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后，便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒，而每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞，再产生出数百个子代颗粒，如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。噬菌体的生命周期

1）烈性噬菌体只有溶菌周期2）温和噬菌体溶源生长周期噬菌体的溶菌生命周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来

噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期：

是指在感染过程中没有产生出子代

噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整

合到寄主细胞染色体DNA上，成

为它的一个组成部分。

现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体

DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。超感染免疫：抗御同种噬菌体再感染的特性。（λ噬菌体的超感染免疫性，具有一种阻遏－操纵体系）溶源性细菌的诱变：经过许多世代之后，溶源性细菌便能够开始进入溶菌周期。

现在对于λ噬菌体的超感染免疫性现象已有相当深刻的了解，它具有一种阻遏-操纵体系。阻遏基因cI编码的阻遏蛋白，与两个分别同启动基因PL和PR相邻的操纵基因OL和OR结合。在溶源性细菌中，cI阻遏基因编码的阻遏物能够持续地合成，而且它的产量就其操纵基因而言是略为超量的。由于阻遏物分子同OL和OR，这两个操纵基因位点相结合，这样RNA聚合酶便无法使用PL和PR，这两个启动子进行转录，因此在溶源性的细菌中，从这两个早期启动子开始的转录是被抑制的。下面我们将会看到，这种状态有充分的能力使原噬菌体保持"关闭"的形式，这就是溶源性细菌能够不停地生长而不发生溶菌裂解的原因所在。

如果λ噬菌体感染了正常的细菌细胞，那么加入进来的λDNA分子的这两个操纵基因将是空闲的，即没有结合上阻遏物分子，因为此时噬菌体的阻遏物尚未合成出来，所以将会发生转录作用。但是，如果一个噬菌体尝试感染一个溶源性细菌，由于在溶源性细菌中早已存在的超量的阻遏物分子，在RNA聚合酶同PL和PR位点结合之前，便会同感染进来的λDNA分子的这两个操纵基因相结合。这种被阻遏物分子结合着的操纵基因，阻止λ噬菌体发育成溶菌状态，我们称这种抑制作用为对同源免疫超感染的抗性。

噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。λ噬菌体载体

1λ噬菌体的性质2构建λ噬菌体载体的基本原理3λ噬菌体应用4体外包装性质1它的研究历史比较悠久，生物学特性遗传背景都有深刻的了解。分子量31×106dal，是中等大小的温和噬菌体，至今已构建成100多种λ噬菌体载体,在重组DNA的研究中有着相当广泛的用途。2在寄主范围方面，较质粒载体要狭窄得多，也就更安全。

3在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，这称为粘性末端，简写cos(cohesive-endsite)。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。4将λ噬菌体基因组人为地划分为三个区域:左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。中间区域约长18kb，

(l)左侧区段自基因A到基因J,分布在基因组左臂,约占1/3基因组。包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成及装配所需要的全部基因。参与噬菌体头部蛋白质合成的有W、B、C、D、E、F等多种基因,参与尾部蛋白质合成的有Z、U、V、G、H和M、L、K、I、J等10余种基因。

(2)中间区段介于基因J与基因N之间,约占λDNA的1/3。包括功能不清的b2区(J-att之间)和控制重组(redA和redB)及溶原性的基因(int和xis)。xis和int这两个基因负责外源DNA删除和整合作用。这个区段又称为非必要区段,所编码的基因与溶菌生长和噬菌斑的形成能力无关,故把λDNA作为载体时,这一区段可被消除或取代。(3)右侧区段自基因N到基因R,分布在基因组右臂,与噬菌斑的形成有关,包括全部主要的调控基因、噬菌体的复制基因(0和P)、S和R是控制寄主细菌发生溶菌作用的两个基因,故称溶菌基因、还有CI、CⅡ、CⅢ、cro四个基因,其中cI基因和cro基因编码的蛋白质都是一种阻遏物,能同操纵基因结合而抑制转录。

λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由λ

-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ

-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态.λ噬菌体载体的改造与构建(一)λ噬菌体DNA的改造野生型的λ噬菌体DNA,并不适于用作基因克隆的载体,必须经过改造,才能适用于基因工程中载体的目的。λ噬菌体DNA的改造主要集中在几个方面。1.消除多余的限制性内切酶位点λDNA作为载体的突出缺点是对大多数常用的核酸内切限制酶都具有过多的限制位点,其中有的位点在基因组的必要区。例如在λ基因组中有5个EcoRI位点，5个BamHI位点，7个HindⅢ位点。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。免疫功能类标记颜色反应类标记2加装选择标记

与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容,λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：1)cⅠ+

，有些λ-DNA载体携带含有EcoRI位点的cⅠ

+

标记基因，这种载体一旦进入高频溶源化突变的大肠杆菌菌株内，就能立即建立溶源状态，形成混浊噬菌斑。当外源基因插入到cⅠ+基因中的EcoRI位点时，导致cⅠ+基因灭活，重组噬菌体因不能建立溶源状态形成透明噬菌斑。阻遏基因cI编码的阻遏蛋白，与两个分别同启动基因PL和PR相邻的操纵基因OL和OR结合。加装选择标记imm4342）imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。3)Spi+(sensitivetoP2inhibition)野生型的λ-噬菌体在被P2原噬菌体溶源化的大肠杆菌中不能进入裂解周期，这种表型称为P2干扰敏感性(Spi+。)，但是缺失了两个重组基因rad和gam的λ-噬菌体在P2溶源菌中将不受P2的干扰而进行正常的无性繁殖(Spi-表型)。在一些λ-DNA载体中外源基因的插入与载体DNA某一片段的缺失同时发生，这段在DNA重组过程中缺失的片段中含有rad和gam基因，因此凡是重组的λ-噬菌体均呈现Spi-表型，即裂解溶源菌形成噬菌斑。

加装选择标记lacZ

lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝透明斑。3.去除λDNA中一些非必要区段：

由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬菌体DNA，也可以随着寄主细胞一道复制和增殖。λ噬菌体头部蛋白质外壳对所包装的DNA大小有严格的要求，只有75%~105%的野生型λDNA长度(约38~52kbDNA)才能被包装成噬菌体颗粒。

因为根据包装限度这一特性知道，只有当重组体DNA分子的长度是局限在包装范围之内时，才能够形成成熟的噬菌体颗粒，反之则不能形成有活性的噬菌体颗粒。当其感染了寄主细胞之后，究竟能否形成正常大小的噬菌斑，这完全取决于重组体DNA分子本身的大小。野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：l-DNA载体的构建：缩短长度

插入型载体插入位点插入片段体外包装体外包装载体长度37kb插入片段大小：（51–37）0-14kbl-DNA载体的构建：缩短长度

取代型载体载体长度26kb最小装载长度10kb插入片段体外包装最大装载长度25kb插入片段插入片段体外包装（36–26）（51–26）4灭活某些与裂解周期有关基因，使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生物污染现象的发生。野生型λ-DNA，甚至经过上述两步改造过的λ-DNA载体，能在几乎所有的大肠杆菌细胞内进行无性繁殖，极易扩散与传播，有可能因DNA重组分子的性质对生物体或人类带来危害。

具体的应付对策是将无义突变（即琥珀型突变)引进λ-噬菌体裂解周期所需的基因内，如W、E、S、A或B等。这种携带无义突变的λ-噬菌体只能在大肠杆菌Kl2的少数菌株中繁殖，因为这些菌株可以通过其独有的特异性校正基因的编码产物(即校正tRNA)，在蛋白生物合成过程中纠正无义突变。(二)λ噬菌体载体的主要类型经改造后构建的λ噬菌体的衍生载体,可以归纳成两种不同的类型。1.插入型载体(insertionvector)

由于改建后的噬菌体λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影响噬菌体增殖。而且噬菌体DNA缺失越长，插入片段就可越大。它们都具有单个克隆位点。也有一些插入型载体具有两个克隆位点,

插入型载体只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上,会使噬菌体的某种生物功能丧失效力,即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性,插入型的λ载体又可以进一步区分为免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。（1）免疫功能失活的插入型载体在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区,其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时,就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏,而不能进入溶原周期。因此,凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑,而没有外源DNA插人的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态学上的差异,为分离重组体分子提供了方便的标志。(2)β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：有一些λ载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ区段，其中编码着β半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在添加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lacZ区段上，阻断了β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种λ重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成β半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。Charon16A载体的构建

Charon16A是一种插入型载体,含有lac5DNA取代物(来自大肠杆菌的lac区段)和imm80免疫性取代区段(来自Φ80噬菌体DNA)。在lac5DNA取代物上有一个EcoRI限制酶的单一位点,位于β-半乳糖苷酶基因〈lacZ)上。这一切点很有用,可通过外源DNA的插入作用使lacZ功能失活,结果在含有色原底物X-gal和lac-指示菌的平板培养基上形成无色的噬菌斑,它可容易地同由两个载体片段简单地再连接形成的亲本噬菌体(携有lacZ基因)所形成的深蓝色噬菌斑区别开来,以利于选择重组体。此外,Charon16A缺失了b区段和nin5小片段,为外源DNA提供了插入空间。为了增加生物学上的制约性,在Charon16A载体的基因A和B上诱发产生了玻泊突变。2.替换型载体(replacementvector〉

替换型载体又称为取代型载体,是在λDNA的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点,酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右双臂分开,由外源DNA片段取代之。在构建此类载体时,安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列,因此当外源DNA插入时,一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉,从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。所以替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入,适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。

在替换型载体中,除去可替换DNA片段后,如无外源性DNA代替,则由左右臂连接起来的缺损性基因组,由于太小不能被外壳包装,因而不能形成噬菌斑。只有在替换上新的外源DNA时,才能形成噬菌斑。这就等于对携带外源DNA的重组体的正选择标记。此外,在替换载体中,可替换的DNA片段上往往具有某种遗传标记基因,以便于选择重组体时与载体相区别。替换型载体λNM791是由野生型λDNA去除约30%非必要区段后,引人大肠杆菌的lacZ基因片段构建而成,在可替换的片段的两端具有两个EcoRI限制性内切酶位点,lacZ基因就在可替换片段上。可以根据一种适用的lac-指示菌菌株的等位基因互补作用予以检测。因而在上述平板上产生无色的噬菌斑,以此区别和选择重组体。

λgtWES-λB’载体是将野生型λDNA上的C片段(位于EcoRI位点2和3之间)切除,造成一个nin5小片段缺失并消除最右边的两个EcoRI切点构建而成的替换型载体。B’片段(在载体构建过程中把B片段倒位了,故称之为B’片段)是可替换的片段,连同上述的这些缺失,为外源DNA提供了插入空间。为了提高载体在生物学防护上的安全性,引人了W、E、S三个基因的琥珀突变(ambermutation),这些特性使从实验室环境中逃逸出重组噬菌体的可能性大大降低了。

四、常用的λ噬菌体载体(一)λgt系列载体

λgt为插入型系列载体。1λgt10载体

λgt10分子量为43.3kb,其克隆效率很高,当外源DNA的量十分有限时常用此载体,也是专门为在其免疫区(imm434)内克隆小的cDNA片段(约6kb)而设计的。当该载体接受的外源cDNA片段比其他免疫性载体短好几个kb时,仍可被有效地包装,故回收短片段的效率比其他载体高约10倍。这种载体的一个突出优点是,免疫区内的两个克隆位点(EcoRI及HinduⅢ位点)都是位于阻遏子基因CI内部,这为重组体的选择提供了许多方便。外源cDNA片段(<7.6kb)插入此处时,使CI基因失活,形成了重组的CI-噬菌体,噬菌斑为清亮斑,可与非重组的CI+噬菌体所产生的混浊噬斑相区别。λgtl1载体λgt11是一个常用的插入型载体,分子量为43.7Kd,基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段,其中编码着β半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌,涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上,会形成蓝色的噬菌斑。在lacZ基因末端(位于终止密码上游53bp处),有惟一的EcoRI位点,可容纳8.3Kb大小的外源DNA片段的插入,导致β半乳糖苷酶基因的失活,并产生出无色的噬菌斑。(二)λEMBL系列载体该系列载体是用来克隆大片段基因组DNA的替换型载体,克隆容量可达20Kb,是构建高等生物基因文库的很有用载体。其中最常用的是λEMBL3和λEMBL4。这些载体多克隆位点上的BamHI位点两侧分别有EcoRI和SalI位点。λEMBL3含有对称的两个多酶位点聚合接头序列SalI-BamHI-EcoRI,以便于SalI、XhoI(同尾酶,都是+TCGA)、BamHI、MboI、BglII、XhoI、Sau3A和BclI(同尾酶,都是+GATe〉及EcoRI等9种限制酶切点外源DNA片段的克隆。在载体AEMBL4中,有长度为13.2kb的中间可取代片段,两个多克隆位点上的限制酶位点顺序刚好与AEMBL3的取向彼此相反。

这两个噬菌体载体可以用来克隆由EcoRI、BamHI和SalI三种限制酶所产生的任何一种限制片段,而且还可以用来克隆从复杂染色体基因组产生的随机片段。染色体DNA经SaU3A限制酶局部消化之后,产生的黏性末端同BamHI的完全一样,都是GATC。如此局部消化所产生的染色体DNA片段,可以通过凝胶电泳按大小分步分离,并克隆到AEMBL3和AEMBL4噬菌体载体上。虽然在克隆过程中载体上的BamHI位点被破坏了,但依据所用的载体,选用EcoRI酶或SalI酶作消化作用,便可以回收到克隆的外源DNA片段。当应用BamHI限制酶处理KEMBL3克隆载体时,往往还要用EcoRI酶或SalI酶从两个位点切割中间的可取代区段,使两臂之间释放出BamHLEcoRI短片段或BamHI-SalI短片段。这样,便阻止了中间的可替换区段与两臂重新形成非重组体分子的可能性。三Charon系列载体凯伦(Charon)噬菌体载体,是F.R.Blattner等人于1977年在λ噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。这类载体有插入型的,也有替换型的,它们在基因工程实验中的用途十分广泛。早期构建的代表性载体有Charon4A、pCharon21A等,近年来构建的Charon32··35和Charon40等新型λ取代载体可接受的外源DNA片段更大,而且可利用的限制酶切位点更多。.Charon40载体

Charon40载体是专门设计用来容纳大片段(9~22kb)外源DNA的替换型载体,它容纳外源DNA的能力几乎接近于理论极限值(23kb)。该载体中间的可取代区段是由一种DNA短片段(lac操纵基因+腺病毒DNA片段)多次重复而构成,其两端各有一个方向互为相反的多克隆位点,分别含有多达16个可用的限制酶切位点,从而增加了可选用的限制酶的种类。在多聚填充片段中,每个短片段之间的连接点可被单一限制酶NaeIN识别。因此,用该限制酶可将多聚填充片段消化成碎片,这些碎片用聚乙二醇沉淀法很容易除去,从而使存活噬菌体大部分都是重组体分子。这是Charon40载体得天独厚的优点。

四具有体内删除特性的λ噬菌体载体λZAP

在应用λ载体作基因克隆获得了阳性噬菌斑之后,必须分离出λ重组载体,把插入其中的外源DNA片段亚克隆到质粒载体上,再进行各项有关的鉴定分析,这是一种相当烦琐和费时的过程。而λZAP载体则是一种可将插入的DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体的快速简便的体内载体系统。λZAP载体的结构

λZAP载体本质上是一种插入型的入噬菌体载体。在它的基因组当中,含有一个可以在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段,其两侧是单链DNA噬菌体fl的复制起始信号(起始子I)和终止信号〈终止子T〉。在pBluescriptDNA序列的内部,有一段两端分别带有T3及T7噬菌体转录启动子的多克隆位点(MCS)区,外源DNA片段在此插入,会导致lacZ基因失活。2.pBluescriptDNA序列的体内删除当含有外源DNA插入序列的重组λZAP载体感染了大肠杆菌F’菌株之后,再用辅助噬菌体M13超感染。由M13噬菌体基因Ⅱ提供的反式作用蛋白质,便会首先识别位于λZAP载体臂上的fiDNA复制起始子I。接着从起始子I处切割DNA正链并沿着pBluescript序列,按滚环模型进行单向性的正链DNA复制。当其到达fl终止子T时,便会被基因Ⅱ蛋白质再次切割。结果此正链DNA的两端便会连接形成一个环形的单链的pBluescript噬菌粒基因组。3.λZAP载体的主要特点λZAP载体是一种特别适于cDNA克隆的并具有体内删除特性的插入型λ噬菌体载体,其主要特点如下。①具有多种不同限制酶的单识别位点,可以克隆约10kb的外源DNA片段。②若插入的外源DNA序列取向及读码结构保持正确,就能从lacZ启动子表达融合的蛋白质,并可用抗体筛选。③能发生β半乳糖苷酶的插入失活效应,故可在X-gal显色反应平板上筛选重组体。④克隆的外源DNA片段,可以在体内自动地从噬菌体载体上删除下来,置于较小型的噬菌粒载体上,便于进行限制图构建和DNA核苷酸序列测定,省去了常规的DNA切割与连接两个步骤。⑤利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶,λZAP载体能够转录出任何一条链的mRNA分子,可方便地在体外制备外源DNA插入序列的RNA拷贝,也可合成出32P标记的RNA探针。

这样便完成了λZAP载体上pBluescriptDNA序列的体内删除作用,它最终被辅助噬菌体M13的蛋白质包装成单链DNA噬菌体颗粒,并被挤压出寄主细胞。将此感染培养物置70℃下加热20min,杀死大肠杆菌细胞及λ噬菌体,而包装着噬菌粒pBluescriptDNA的M13颗粒,因具热抗性而得以存活。再用它感染F’大肠杆菌细胞,并涂布在含有氨苄西林的平板上,选择抗性克隆细胞,便得到了pBluescript双链噬菌粒DNA(ColE1复制起点)。DNA片段之间的结合，完全是按一种随机的方式进行的。由此所形成的各种重组体分子

五λ重组体DNA分子的体外包装1λ重组体DNA分子的转染作用应用DNA重组技术，把带有目的基因的外源DNA片段插入到λ载体之后，还要设法将这些重组体分子导入寄主细胞。最简单的一种方法是用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染(transfection)，它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导(transduction)。

从本质上讲λDNA的转染作用，同质粒DNA的转化作用并无原则上的差别。但前者是一种低效的过程。即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率(即每微克ADNA转染产生的噬菌斑数目)，也仅为105一106之间。

而实际上在基因操作的过程中λDNA总是要经过一定的处理，包括用核酸内切限制酶作消化反应之后，再同外源DNA片段进行的连接作用。实验观察表明，这种体外连接的结果，转染效率便下降到了104一l03左右。而且就是使用生化上完全有效的λ重组体DNA，这种下降现象也往往是难以避免的。

造成这种转染效率下降的主要原因是，在DNA的体外连接反应中，有相当的比例是没有活性的。这样的分子不能够转染寄主细胞。λ重组体DNA转染作用的低效性，显然是难以满足一般的实验要求，特别是应用λ载体构建基因文库的操作中，至少要达到106左右的转染效率，甚至更高一些。

所以应用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞。结果明显地提高了λ重组体DNA的转染效率，可达107

。

所谓λDNA的体外包装作用，就是要在体外试管中，完成发生于寄主细胞内的全部包装过程。根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾部装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。

D基因突变的和E基因突变的λ噬菌体，是一对互补的头部突变型噬菌体。这两个基因的产物都是重要的外壳蛋白质，其中E基因的产物E蛋白是λ噬菌体头部的主要成份，占头部总蛋白的72%。D基因的产物D蛋白占总蛋白的20%，它位于λ噬菌体头部的外侧，同λDNA进入头部前体以及头部的成熟有关。E基因发生了琥珀突变(Eam)的λ噬菌体不能形成任何头部结构，所以在它所感染的寄主菌中可以积累大量的尾部蛋白质;

而D基因发生琥珀突变(Dam)的λ噬菌体，λDNA不能进入头部，成熟作用便在头部前体阶段被阻断，因此它所感染的寄主菌中可以累积大量的头部前体蛋白质。由于这种细菌的溶菌物在体外是彼此互补的，因此λDNA分子能够被包装成为成熟的噬菌体颗粒。

区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法是用Xgal蓝色噬菌斑试验。有些噬菌体载体的中间片段带有编码β半乳糖苷酸的基因。当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）的培养基上生长时，半乳糖苷酸与Xgal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。因此，含有中间片段的重新恢复的噬菌体形成蓝色噬菌斑；而同外源DNA连接的重组噬菌体形成的噬菌斑是无色透明的。

噬菌体λ裂解生长的能力同包装在头蛋白中的λDNA的大小有关。当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段连接，包装成重组噬噬体。这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源DNA的连接。l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体

琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株琥珀型突变ambermutation（AAG→UAG）,这是以最初与埃皮施泰因和施泰因贝格（R．H．Epistein和C．M．Steinberg）一起从T4噬菌体中分离这种突变株的贝尔施泰因（H．Bernte-in）的名字来命名的。因为德语Bernstein（琥珀）的英译为amber，所以称这种突变为琥珀型突变。当ORF中的一个密码子突变为琥珀型终止子后，生物体采取了一种措施，原来此密码子对应的反密码子也突变为与琥珀密码子配对，从而是ORF阅读后的产物和突变后的产物一样．这样就对突变进行了抑制．将本来编码氨基酸的密码子突变为琥珀密码子UAG而提前终止转录，这样翻译出来的蛋白质是截断而且不能形式正常功能的。很多单基因病如一些类型的地中海贫血就是因为这种突变而引起产生的血红蛋白不稳定导致溶血性贫血。琥珀突变抑制,可以抑制此类突变。

l-DNA载体的主要类型：插入灭活型载体:Charon2、Charon6、lgt11取代型载体:lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正选择型载体:lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑l-DNA重组分子的体外包装：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的.l-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时

,用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒

,密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解

,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA.M13噬菌体的基本特性生物结构:M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成，不裂解宿主细胞，但抑制其生长，DNA全长6407个核苷酸，至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌，即F’或Hfr细菌。

当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体DNA转变成双链复制型（RF）。从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时，M13开始不对称的合成，即只大量合成DNA双链中的一条链。单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV一M13噬菌体的感染与复制过程

M13噬菌体在感染时,首先吸附在雄性大肠杆菌F性纤毛的末端。当感染的M13颗粒穿过性纤毛时,其外壳蛋白质便会脱落,M13(+)链DNA在基因3编码的向导蛋白质引导下,进入到大肠杆菌寄主细胞内。

进入细胞内的M13(+)链DNA便起到一种模板的作用,在基因3产物的作用下,先从一个RNA引物开始,通过宿主DNA聚合酶Ⅲ延伸,合成出互补的(一)链DNA。由此形成的双链形式的DNA,称为复制型DNA(RFDNA)。

RFDNA按θ形式进行几轮复制(可产生200个拷贝)之后,基因2的产物便在RFDNA的正链特定位点上做切割反应,形成一个缺口。

利用大肠杆菌DNA聚合酶I,以环形的M13(一)DNA为模板,通过滚环复制合成M13(+)链DNA。在基因2产物的作用下,新合成的(+)DNA便会被切除下来,并环化形成单位长度的M13基因组单链DNA。

由基因5编码的单链特异的DNA结合蛋白质,与(+)DNA链结合,形成特异的DNA-蛋白质复合物,然后转移到寄主的细胞膜,结合蛋白质从(+)DNA链上脱落来,

M13(+)DNA链在从细胞膜溢出的过程中,被外壳蛋白质包裹成M13子代噬菌体颗粒,并通过细胞壁挤出释放出来。可见,M13噬菌体DNA复制的结果并不会导致寄主细胞发生溶菌效应。二、M13噬菌体载体的构建噬菌体现已被发展为一种通用的克隆载体,它们在Sanger设计的双脱氧DNA序列分析法中有特殊的用途。M13的RFDNA在寄主细胞中是以高拷贝数的形式存在的,所以很容易纯化出来供作基因克隆载体使用。M13感染的细菌培养物,经离心处理除去大肠杆菌细胞及其碎片之后,存留的上清液中可以有效地制备到M13噬菌体颗粒,从而有利于制备大量的单链模板DNA。M13DNA载体的构建：野生型M13RF-DNAM13mp系列载体lacZ‘polylinkerIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIIIIVIIIVIIXVVIIIXVIII(一)M13mp1的构建M13噬菌体基因组由6407个核苷酸组成,共有10个基因。已知在M13基因Ⅱ和Ⅳ之间(5498~6005核苷酸),有一个长度为507个核苷酸的基因间隔区段（IG区段）,在这个间隔区段上存在着M13DNA的复制起点,但该区段的完整性对噬菌体的发育功能并不重要。Messing等人首先将乳糖操纵子HindⅡ限制片段插入这个间隔区的BsuI酶切位点上,获得M13mpl。这个HindⅡ限制片段含有大肠杆菌乳糖操纵子调节区段（I、P、0）和编码β-半乳糖苷酶基因的头145个氨基酸密码子即α-肽链(lacZ’)。α肽虽然没有酶活性,但当M13mp1、感染缺失了β-半乳糖苷酶α-肽链的宿主菌JM103时,会导致α互补而产生有活性的β-半乳糖苷酶,在含有诱导物IPTG和X-gal的培养基上形成蓝色噬菌斑。

M13mp1载体的获得,在发展M13载体系列的研究工作中,占有十分重要的地位。随后出现的一系M13‘载体都是在它的基础上经改建派生出来的。(二)M13mp2和M13mp3载体的构建M13mp1不含有对基因克隆特殊有用的限制酶位点。Gronenborn和Messing利用碱基转换突变,将一个EcoRI限制位点导人M13mp1载体的lac区段上,创造出EcoRI限制酶位点,获得M13mp2和M13mp3两个载体。

这两个载体的EcoRI位点分别在β半乳糖苷酶α-肽链的第5个和第119个氨基酸的相应密码子位置上。因此它们比起M13mp1已有了很大的改进。M13mp2是一种最简单的M13克隆载体,被它感染的相应的大肠杆菌寄主细胞,仍会产生出有功能活性的β-半乳糖苷酶。而当具有EcoRI黏性末端的外源DNA片段插入到该载体的lacHindⅡ区段上这个唯一的EcoRI位点时,会使β半乳糖苷酶失活。所形成的重组体分子可以通过X-gal显色反应方法加以辨别。(三)M13mp7载体的构建M13噬菌体载体的进一步重要的改良工作,是将一种化学合成的具多克隆位点的衔接物加入到M13mp2的EcoRI位点上,以使其克隆位点的组成范围得以扩展,成为适用于多种限制酶的克隆载体。M13mp7噬菌体载体的实际构建过程相当复杂。主要是在EcoRI位点上引人一个以PstI为中心位点,两边含有对称排列的BamHI、SalI、AccI和HindⅡ位点的化学合成NDA片段(聚合接头);并通过诱变处理除去基因3的BamHI、基因2的HindⅡ和AccI位点,从而获得了M13mp7载体。该载体仍有感染性,仍能指导β半乳糖苷酶α肽的合成。(四)M13mp8和M13mp9载体的构建M13mp7载体带有一段由对称排列的多种限制位点所组成的多聚衔接物,这种结构在克隆外源DNA片段时有一个明显的缺点。为了克服M13mp7载体的这种局限性，1982年Vieira和Mesing构建成一对新载体M13mp8和M13mp9，将上述化学合成的DNA片段改变成每个位点只有一个，再增加了HindⅡ、SmaI和XmaI位点。M13mp8和M13mp9在克隆区的内切酶位点顺序刚好相反。这两个载体对于具有两个不同酶切位点末端的外源DNA片段，可以通过"强制克隆"而定向连接。(五)M13mp18和M13mp19载体的构建1983年,Nerrander等构建了M13mp10和M13mp11,在聚合接头中增加了SstI和XbaI位点。最近的一对新载体M13mp18和M13mp19各有一条54bp长的聚合接头,又增加了SphI和KpnI位点，共有13种单一限制酶切点。目前，实际上几乎所有克隆都使用MUmp18和MUmp19进行。这两个载体在lacZ区内的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点(只是在多克隆位点的方向上有所不同)，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。当采用两种不同的限制酶切割RFDNA以后,两个载体不会轻易自身再环化，仅当具有匹配末端的外源双链DNA片段存在时，才可闭合成环。三、M13噬菌体载体系列的优点M13载体系列特别适用于克隆单链的DNA分子。与其他载体相比,它具有两个十分有用的优点。①在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段(lacHindⅡ片段)，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列。②M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。例如：在M13mp18和M13mp19中，外源DNA片段将以两个互为相反的方向插入，这样在M13mp18重组体的子代噬菌体内含有外源DNA的一条链,而M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用这一对载体就可以只用一个引物，从所插入DNA片段的任一端开始,测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb第三节柯斯质粒、噬菌粒等其它载体l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5

kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。柯斯质粒与噬菌粒在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建柯斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于柯斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。一柯斯质粒:1978年Collins和Hohn人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，柯斯质粒顾名思义就是含有λ-DNA两端cos区的质粒，命名为cosmid（cossitecarryingplasmid）。

考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：1978年Collins和Hohn发明构建1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kbpHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI柯斯质粒的优越性能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞，但由于黏粒载体并不含有λ噬菌体的全部必要基因,因此它不能够通过溶菌周期,无法形成子代噬菌体颗粒。2.具有质粒载体的特性黏粒载体具有质粒复制子,因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制.此外,黏粒载体通常也都具有抗生素抗性基因,可供作重组体分子表型选择标记,其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。另由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA。重组操作简便，筛选容易5不能体内包装，不裂解受体细胞采用柯斯质粒作载体的困难是：1载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。2大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段.二噬菌粒

M13噬菌体载体克隆外源DNA的实际能力十分有限,这就局限了该类载体在真核基因克隆中的实用价值。为了解决这个问题,已经发展出了一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的特点：

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便，筛选容易1pUC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构pUC118和pUC119噬菌粒载体是一对分别由pUC18和pUC19质粒载体与野生型M13噬菌体的基因间隔区重组而成的噬菌粒载体。M13间隔区插入在pUC18和pUC19质粒的NdeI位点上,长度为476bp,含有M13噬菌体的复制起点。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反外,两者的分子结构完全一样。重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA2pUC118和pUC119这一对载体具有两种不同的复制形式①在寄主细胞没有感染上辅助噬菌体M13的情况下，pUC118和pUC119噬菌粒载体的复制如同双链质粒载体DNA一样，是受起源于CoiE1质粒的复制起点控制的。由此产生的双链载体DNA分子仍然保留在寄主细胞内。②当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染之后，pUC118和pUC119载体受M13噬菌体复制起点的控制，便转向按照M13噬菌体的滚环模型进行复制。所产生的单链载体DNA分子，可被包装进由辅助噬菌体提供的外壳蛋白质中。形成的噬菌体颗粒随后被挤压出寄主细胞。

最常见的辅助噬菌体是M13K07,它是M13的一种衍生菌株。辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变体,但它们可以为寄主细胞中的质粒DNA的复制与包装提供所需的酶蛋白和外壳蛋白。3pUC118和pUC119噬菌粒载体的优点pUC118和pUC119噬菌粒是一对目前常用的基因克隆载体,它与其他的pUC克隆载体相比,具有下面的优点。1）分子量小,仅为3.2kb,克隆能力高,可达10kb的外源片段,易于进行体外分离与操作。2）拷贝数含量高,每个寄主细胞可高达500个。3）含有一个质粒的复制起点,在没有辅助噬菌体的情况下,克隆的外源基因可像质粒一样按常规方法复制,形成大量的双链DNA分子。4）又带有一个M13噬菌体的复制起点,在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中,可合成单链DNA拷贝,包装成噬菌体颗粒并分泌到培养基中。5）在这两个载体中,多克隆位点区的核苷酸序列取向彼此相反,它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA,另一个则可转录负链DNA。6）可以直接对克隆的DNA片段进行核苷酸序列测定,省去了从质粒载体到噬菌体的烦琐亚克隆步骤。噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录

三酵母菌载体系统酵母菌是一种低等真核生物，它对于研究真核细胞的DNA复制，基因的结构与功能以及外源基因的表达都是十分有用的。

酵母本身具有一种质粒，是一种双链环状染色体外DNA分子，由6300bp组成，在电子显微镜下观察，平均周长为2um，所以称为2u质粒。该质粒在每个细胞中有约100个拷贝，每个质粒DNA具有EcoRI、XbaI和Hpal三种酶的切割位点。其全部基因组含有一个由45bp组成的复制起始点和三个结构基因。2u质粒作为克隆用载体最大的问题是稳定性不好，而且容易丢失。所以人们一直设法在2um质粒基础上，构建出增强其稳定性，提高表达效率的质粒。改造构建的酵母质粒通常要具备几个共同的条件:1首先应含有合适的内切酶位点以便外源性DNA的插入.2还应该具有大肠杆菌的抗生素抗性标记(Ampr、Tecr)及在酵母中便于选择标志，一般为色氨酸(tryptophan，Trp)、亮氨酸(leucine、Leu)、组氨酸(histidine)和尿嘧啶(uracil、Ura)等的合成基因，通过转化这些基因产物缺陷型的酵母菌进行筛选。3能够先转化大肠杆菌，并且在其中扩增，得到高拷贝数，然后是可以再转化酵母菌。这种既能转化原核生物细胞又能转化真核生物细胞的载体质粒，称为穿梭质粒(shuttlevectors)。

酵母细胞系统常用的基因克隆和表达载体，根据它在细胞内的复制和存在形式，分为下列几类，

l.YIP酵母整合型质拉YIP由大肠杆菌质粒、酵母选择标记基因组成，但不含自主复制序列。所以YIP型质粒进入细胞后，由于同源重组被整合到染色体上，并随着染色体复制而复制。转化频率很低，10个转化子/ugDNA，但一旦出现转化子，便是整合到染色体上的。因为它不含自主复制序列，不能在酵母细胞染色体外单独复制。转化子是非常稳定的，在非选择性培养基中，每个世代的分离率大大小于1%。

非复制型载体又称整合型载体，用YIp(yeastintegrationplasmid)表示。整合型质粒载体不含酵母DAN复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区，可通过DNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与LEU2标记相同

YRP酵母复制型质粒YRP由大肠杆菌质粒、双选择标记TRP1和URA3、染色体ARS序列组成。因为含染色体DNA的自主复制序列ARS，所以转化频率较高，103~104转化子/ugDNA，但转化子不稳定，在没有选择性压力的情况下，培养10代，仅10%的细胞带有质粒。在酵母细胞内是多拷贝的。如果质粒上的DNA与寄主细胞染色