第三章：PCR技术及应用

PCR技术分子生物学检验技术教师：刘莉娜主要内容PCR的反应原理、过程PCR反应体系及条件PCR特点PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.Mullis

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB

引物dNTPMg2+5’3’Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段一、PCR反应的原理和过程72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸（一）基本原理

变性、退火、延伸

PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火(二)反应过程变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板；退火（复性）：温度降至40~60℃左右，引物能与模板DNA单链互补配对结合；延伸：72℃左右，DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链互补的半保留复制链；重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新链又可成为下次循环的模板。

一生二、二生四、四生万物

TaqP1P2二、PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+PCR反应体系成分模板（template）引物（primer）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）酶（TaqDNApolymerase）Mg2+（magnesium）反应缓冲液（buffer）（1）模板①单、双链DNA均可②模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一，因此，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。③模板浓度要适中，过高导致反应的非特异性增加。（2）引物引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L之间，浓度过高容易生成引物二聚体或非特异性产物；理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则（1)用于PCR反应的引物需要两条，位于扩增区两端，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以18-25bp为宜。（3）两引物间避免有互补序列。（4）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（5）两条引物Tm值不能差别太大。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制（3）dNTP

①dNTP浓度取决于扩增片段的长度一般为20~200μmol/L②四种dNTP浓度应相等，不等会导致错配率升高；浓度过高易产生错误碱基的掺入，

浓度过低则降低反应产量

TaqDNA聚合酶来自嗜热水生菌(Thermusaquaticus)，耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能，错配率为8.9×10-5至1.1×10-4。标准使用浓度一般为2.5U/50l。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影响产量。

（5）Mg2+

①Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。②Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。一般为1.5mmol/L。③Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（6）反应缓冲液反应体系维持酶反应的最适pH一定盐离子浓度破坏二级结构的二甲基砜（DMSO）保护酶的物质10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。三、PCR反应条件的选择PCR反应条件:温度时间循环次数设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在95～97℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想引物的退火温度

通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）退火温度=Tm值-（5～10℃）-在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性退火时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行循环次数循环次数-决定PCR扩增程度循环次数-主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCR反应特点

特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。从理论上，其能在2~3小时内，将1个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。而就特定的扩增反应来说，从理论上，只要反应管中有1个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有2~3个以上的靶分子，即可成功的通过PCR扩增，将其检测出来。整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的TaqDNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。整个扩增反应可在2～4小时完成。某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。32常见的几种PCR1、逆转录PCR（RT-PCR）2、巢式PCR3、RACE4、反向PCR5、定量PCR--RealTimePCR