复方药效物质基础研究思路与方法

复方药效物质基础研究思路与方法

近年来，随着细胞生物学、计算机科学、现代铬技术的深入，以及重组参数、基因检测等先进科学技术的深入，中医指纹谱的研究和高流量筛选技术和综合化学技术的应用已经开始应用于中医复方物质基础的研究。先进的中医药科学的联合应用对澄清中医复方的物质基础和作用机制具有极其重要的意义。促进中医药现代化和中医药在世界上的发展具有极其重要的意义。中药复方的药效物质基础是指中药复方针对某一病症发挥药效作用的全部活性药效物质总和。这些活性物质来源复杂,包括复方原单味药材固有成分、制备过程形成的产物(如炮制加工、煎煮过程)等。复方的药效物质基础不是全方成分机械地组合,而是多种活性物质协同作用的结果。一、复配中分双方动力学参数从上世纪90年代开始,我国的复方药效物质基础研究开始了百家争鸣的局面,其中的许多理论对我们今后的研究提供了积极的指导作用,甚至有些思路我们至今还在应用,所以了解复方药效物质基础研究的发展对我们今后的工作有着重要的意义。早在1991年黄熙等就提出“证治动力学”假说,认为病症的状态可以显著改变复方的药动学参数。在1997年又将学说进一步提升为“复方效应成分动力学”强调药物配伍对体内效应成分彼此动力学参数有很大影响。该学说的提出有利于阐明复方方剂配伍的科学内涵,发现方剂与机体之间的相互作用规律。薛燕于1996年提出了复方霰弹理论,认为中药复方有多种有效成分组成,在人体内通过多种有效成分的相互作用或产生新的活性物质而发挥药效。该理论丰富了我们对复方的认识,强调了复方的整体性,为后来的复方研究提供了重要的理论依据。1998年周立东在“全球华人中药现代化学术研究讨会”上提出了把“定量组效关系”应用于中医药复杂体系的研究,开启了多组分化学物质和多变量药效指标的构效关系研究模式。该方法与中医理论辩证的思维模式一致,在复方药物作用机理解释、有效部位研究、单体药物筛选等方面有着积极的意义。2000年曹治权提出了中药复方有效化学成分研究的配位化学学说,认为复方中的有效物质是有机物与微量金属元素的结合物,某些配位化合物相比纯有机成分更能反映中药的物质基础。该理论为我们研究中药复方开辟了另外一条新途径,而多篇文献的试验结果也验证了该理论的合理性[5~9]。2001年王本祥等提出了对中药复方研究的不同见解,认为分析复方的物质基础应当分清主要成分和次要成分,并提出了“主要有效成分和次要有效成分综合效应论”,解决问题应当先抓主要矛盾即主要成分,其次考虑次要矛盾即次要成分。该方法虽然从简入手却能抓住主干,为复方药效物质基础的研究起到了重要的方法学引导作用。二、植物化学的应用伴随着研究复方药效物质基础的各种学说出现的同时,研究方法也在随着学说的指导而迅速发展。从最早的单味药材系统分离方法到拆方研究再到整方研究,植物化学为我们提供了强有力的手段。经过多年的研究,这些方法为复方物质基础的解释做出显著的贡献[11~14]。由于分析技术的迅速发展以及各学科的交叉加速融合,中药复方的研究方法和技术也越来越多,发展越来越快。下面就各种新技术和方法的应用作具体的介绍。1.中药复方组学研究杨奎等于1998年提出的中药复方组合化学研究方法,是以中药复方为天然组合化学库(NaturalCombinationalChemicalLibrariesNCCL),在中医药理论的指导下建立能反映该复方主治病证的病理生理的药理学评价指标,通过部位或单体成分的多靶点组合筛选,找出其活性最强的配伍,即确定为方剂的有效部分。杨奎等进行了中药复方组合化学研究的方法学探索,采用二元索引库筛选法进行川芎、天麻提取物的复方组合化学研究。经分析比较,找出了活性最强的两组活性构件,即川芎醇提物+天麻醇提物是组合复方抗血小板释放5-HT作用和阻滞血管内皮细胞钙通道作用的物质基础。罗国安等应用组合化学的研究思路开展中药复方药效物质基础作用机理相关性研究,并于2006年将该方法发展为化学物质组学。在对清开灵注射液的研究中,作者应用化学物质组学对各类化合物建立了相应的指纹图谱,设计了整体到细胞的多种模型共计51个药理学指标,最后确定清开灵治疗脑缺血损伤的4类有效组分是胆酸类、黄芩苷环烯醚萜类及珍珠母提取物,此4类物质组成了清开灵注射液的有效化学物质组,揭示了清开灵注射液的药效物质基础。开展中药复方的组合化学研究,可以简化方剂的分子多样性,开发“有用的分子”组合的精简方剂,是一种既体现整体观,又强调辨证分析的方法。该研究方法为中药复方的二次开发提供了重要的指导思路。2.味地黄丸的药物成分上世纪80年代,日本学者田代真一提出了“血清药理学”与“血清化学”的理论概念。国内则由王喜军于1997年正式提出了“中药血清药物化学”的概念与实施细则,通过结合体外血清药理活性测定的方法,进行血清中有效成分的分离鉴定。该方法是将复方入血成分进行体外活性筛选,最终确定复方的有效成分及其代谢产物。M.Homma,等应用血清药理学和血清药物化学的方法对Saiboku-To进行研究,HPLC/DAD检测结果发现给药后的样品中多出了3个新峰,经验证分别是magnolol,8,9-dihydroxydihydromagnolol和liquiritigenin,因此推断此三种成分为Saiboku-To的药效成分。国内的血清药物化学起步较晚,王喜军等通过对六味地黄丸的血清药物化学研究,对大鼠的含药血清中5个成分进行药效关联性验证,结果证实其稳定地转移了六味地黄丸原方的药效作用强度。对越橘的体内血清吸收物质研究证明,该药的主要入血成分为熊果苷与金丝桃苷。以其活性指标为引导,指导大孔吸附树脂纯化工艺的建立,所得的有效部位制剂富集并提高了抗病毒、祛痰、镇咳的药理活性。此外,王平等采用HPLC-DAD\MS的方法研究了当归补血汤的入血成分,从口服给药后的大鼠血清中找到46个入血成分,鉴定了其中10个原型成分,分辩出21个可能代谢组分。血清药理学和血清药物化学的提出,建立了新的复方药效评价系统,有助于对复方的有效物质基础的研究,为复方的二次开发提供了新的方法。但现阶段的血清药理学仍存在一定的缺点,如人与动物的肠道菌群不同,所以血清提供者最好是人。病人即有与证相符者,亦有与证不相符者,即使找到了既与证相符,又显现出临床效果的患者,但要采取足够的血液还会有些困难。因此“血清药理学”的方法存在着一定的局限性。3.复方部分功效成分谱效关系是建立在指纹图谱的研究之上,应用色谱及其联用技术,最大限度地获取有用的化学信息。将标示活性成分群特征峰的中药指纹图谱与药效结果对应起来,将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效结果联系起来,建立中药谱效关系,反映复方内在质量。宁犁丽等对吴茱萸汤的药效物质基础进行研究,通过谱效关系分析发现,在吴茱萸汤中能产生4、9、10和12号峰的化学成分(9号峰确定为吴茱萸次碱)对给定的两个药理指标(镇痛和止呕)成正相关,说明这些物质是吴茱萸汤的主要药效物质。卢红梅等对鱼腥草注射液进行谱效分析,发现在色谱图中17-21min中的色谱峰才是药效的主要相关峰,其中包含的主要化合物有甲基正壬酮、癸酰乙醛、月桂醛、辛醛、β-蒎烯、β-芳樟醇、l-壬醇、4-松油醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、癸酸和乙酸香叶酯,其中3种有效物质的活性与文献报道相符。在谱效关系中指纹图谱技术和药效评价系统两者紧密结合,药效评价的模型筛选是重中之重,否则谱效关系就不能正确反映复方中的药效物质基础。4.中药超高通量筛选技术的研究中药复方所产生的疗效是其有效成分多靶点生物效应的综合作用。多靶点的高通量筛选技术应用于中药复方的研究,就是针对中药复方多成分调节作用的多靶点特性,通过配体-受体的药物研究理论,可以进行药效物质作用靶点分析和有效成分的快速筛选、确定。近年来随着生物芯片技术的发展,以基因、受体、酶等为药物作用的多靶点高通量筛选技术在中药有效成分筛选、分离、发现等的研究中发挥越来越大的作用。X.Sun等用(细胞外)膜片钳技术构建体外培养的皮质神经元模型,筛选了22种中药对N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗作用。试验结果显示黄芩、粉防己、鼠尾草等水提取物能阻断N-甲基-D-天冬氨酸的通路。S.el-Mekkawy等以寻找HIV-1受体拮抗剂为目标,从灵芝子实体所包含的化合物中发现GanoderiolF和ganodermanontriol有抗HIV-1受体的活性,其有效抑制浓度7.8mg/ml。目前,国际上发展的超高通量筛选(UHTS)正在逐步取代HTS,每日可筛样品数万个,筛选成本大大降低,这项技术的应用将加快中药现代化研究的进程。但是高通量筛选的局限性也是十分明显的,一方面是该技术不能充分反映药物的全面药理作用,另一方面是没有全面反映机体生理机能的理想模型。5.渗析-hplc研究由于现代分子生物学的发展以及分子生物学和药物化学紧密结合,色谱界产生了新的技术-分子生物色谱技术。该技术是基于生物大分子的特异性识别来分离和测定活性化合物,在中药特别是复方活性成分的分离鉴定中具有广泛用途。该技术包括固定血清蛋白生物色谱、固定生物膜色谱以及微量渗析-HPLC技术。H.L.Wang等用人血清白蛋白(HSA)生物色谱技术研究了茵陈蒿的甲醇提取物在色谱柱上的结合状态,发现了5个保留峰并鉴定了其中的2个化合物滨蒿内酯和茵陈新,说明这2个化合物具有生理活性。X.Q.Mao等首先采用固定脂质体柱色谱(ILC)的方法筛选当归中的活性成分,从ILC的色谱图中找到了10个色谱峰,其中两个化合物鉴定为阿魏酸、藁本内酯,二者曾被报道是当归中最重要的有效成分。XiaodongHuang等用微量渗析-HPLC技术应用于川芎活性物质的筛选,将川芎和川芎血浆结合物进行微量渗析色谱分析,从HPLC的色谱峰中鉴定了阿魏酸和3-丁基酞内酯,其中3-丁基酞内酯显示了较强的结合力,说明其活性较强。分子生物色谱不仅可以研究复方效应物质基础,还将有助于阐释药物的分布、排泄、代谢、活性、毒副作用及体内生物转化,在中药复方物质基础研究中具有巨大的应用潜力。6.中药复方的活性成分中药服用后,只有部分成分被吸收进入体内,而进入体内的成分既可能以原形,也可能以代谢物的形式发挥作用。越来越多的研究显示,许多中药中的化学成分经过生物转化变成代谢产物后才具有生物活性。因此,只有将原型成分的代谢动力学研究与代谢产物的研究结合起来,才能更好地阐明中药复方作用的物质基础及其配伍原理和作用机制。代谢研究有两种方法,但在具体试验中通常是两种方法结合应用。方法一是通过给药后对动物血液、尿、胆汁、胃液、肠液、粪便等进行分析、分离,从而发现复方在体内真正发挥药效的物质,进而研究物质基础和复方作用机理。KanoY等在口服中药方剂甘草附子汤后大鼠的血中分析出桂皮酸和6E,12E-十四碳二烯-8,10-二炔-1,3-二醇,并由此推断这两个化合物可能是活性化合物。谭锐等对麻黄汤在人工胃、肠液中和大鼠灌胃给药后的不同时间段胃、肠、血液中的活性成分变化进行了比较,进一步证实了麻黄碱和甘草酸作为活性成分能被机体迅速吸收。方法二是通过分析复方在人工胃液、肠液及肠道菌丛中可吸收成分及其转化特征,结合药效学的结果分离中药复方有效成分。代谢研究法可以有效地排除大量的无效成分的干扰从而更加快速的发现真正起作用的有效成分。国内杨秀伟等对化合物的体外代谢研究取得了很多成果,如七叶树总皂苷具有抗肿瘤活性,而对七叶树皂苷-Ia的肠内细菌代谢物进行研究,发现其代谢产物去乙酰七叶树皂苷I也具有抗肿瘤活性。华蟾毒精和羟基华蟾毒精经过人肠内细菌代谢后,分别产生代谢产物去乙酰基华蟾毒精和去乙酰基羟基华毒精,原型化合物具有强抑制人癌细胞生长活性,而两个代谢产物却无活性。中药芍药的主要化学成分芍药苷(paeoniflorin)在人肠内厌氧性细菌的作用下转化为20(R,S)-芍药苷代谢素-I[20(RS)-paeonimetabolin-I],转化产物的抗癫痫活性是原形化合物的2.4倍。石蒜中的加兰他敏(galanthamine)原形化合物与其在人体内的代谢产物0-去甲基加兰他敏(CYP2D6催化产物)相比,在选择性抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性上,代谢产物比原形化合物强10倍。复方的代谢研究为打破长久以来困扰中医药“知其然,不知其所以然”的尴尬局面提供契机;也将为建设符合中医药学科规律的ADME/Tox新药筛选平台奠定坚实基础。7.从生物活性成分角度对复方黑箱的整体生物作用和代谢组学系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成,以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。系统生物学利用各种基因组学和蛋白质组学的技术,来研究生物种属间分子影响差异,从而外推环境化学在种属间作用过程,建立数学模式评估mRNA、蛋白质、代谢水平的变化或差异,阐明整体生物学效应。中医药理论特色是整体性,而复方作为中医治病的主要应用方式,其疗效是体内多靶点协同作用的综合结果。系统生物学的出现很大程度上符合了中医的整体理论,为解开复方黑箱之谜提供了有力的武器。在系统生物学体系中,代谢组学是近几年的研究热点。王喜军等将代谢组学应用于茵陈蒿汤的研究,明