多聚赖氨酸包被处理的国产载玻片对氨基修饰寡核苷酸的固定

多聚赖氨酸包被处理的国产载玻片对氨基修饰寡核苷酸的固定

基因芯片技术是在美国转移基础上发展起来的一项高效、快速、高流量基因检测技术。目前，它已非常广泛。该技术主要包括基因片段的制备、基因芯片的制备、检测和混合、芯片扫描分析等基因芯片生产过程中，片基表面处理是光刻化学中最重要的因素，直接影响芯片的质量。dna芯片是目前应用最广泛的基因芯片。其中，偶氮芯片通常由具有元素基、基或环合基或环合基的载玻片制成片基，小型dna通常由多聚基亚太平针片制成片基。在这项工作中，我们讨论了不同处理方法对dna固定率的影响，并为制作dna芯片奠定基础。1材料和方法1.1荧光标记pcr和mssDNA片段制备所使用的PCR扩增试剂(其中Taq酶为Taqplus,PCR缓冲液中含有Mg2+)购自上海生物工程公司,PCR产物用MoBio公司的Ultraclean试剂盒回收;aminoallyl-dUTP和荧光标记染料Cy3购自Amersham公司;荧光标记的PCR产物用Qiaquicknucleotideremovalkit回收;进口点样液MSS,购自ArrayIt公司.载玻片Ⅰ为国产帆船牌载玻片,用多聚赖氨酸自行包被处理;载玻片Ⅱ为聚赖氨酸包被玻璃片,购自Sigma公司.CartesianTechnologies公司PixSysTMPA5500芯片点样仪,Packard公司ScanArrayLite芯片扫描仪,基因公司CL-1000紫外交联仪.1.2测试方法1.2.1p的pcr扩增寡核苷酸长度为33bp,3′端带有1个氨基,5′端带有1个分子的Cy3,由上海生工合成.用MSS、3×SSC和水分别溶解,浓度为0.25pmol·μL-1.DNA片段长度为1079bp,来自于CP4EPSPS基因,该基因全长1368bp.该DNA片段通过PCR方法制备,PCR反应体系为:1UTaq酶,1×PCR缓冲液,0.2mmol·L-1dNTPs,20ng·μL-1模板DNA,0.25μmol·L-1引物,反应体积为100μL.反应程序为:95℃5min,94℃30s,58℃1min,72℃1min,34个循环,72℃10min.PCR产物用Ultraclean试剂盒回收纯化,用MSS(点样液1)、3×SSC(点样液2)和水(点样液3)分别溶解,浓度为500ng·μL-1.1.2.2多聚赖氨酸包的制备(1)载玻片清洗.载玻片依次用去污剂、自来水、蒸馏水洗涤,再置于清洗液(2.5mol·L-1NaOH,体积分数为60%乙醇)中浸泡振荡至少2h,然后用双蒸水振荡洗涤4次,每次5min,800r·min-1离心干燥.(2)多聚赖氨酸包被处理.将载玻片放在载玻片架上,完全浸入多聚赖氨酸溶液中,在摇床上轻微摇动1h后,用双蒸水洗涤1min,然后室温条件下,800r·min-1离心5min,干燥后室温下避光贮存于干燥器中,3周以后使用.1.2.3荧光染料pcrPCR反应体系同上,仅dNTP终浓度不同,为:0.2mmol·L-1dATP、dGTP、dCTP,0.12mmol·L-1dUTP,0.8mmol·L-1aminoallyl-dUTP.PCR产物经电泳纯化,加入荧光染料Cy3,混合均匀,黑暗中25℃水浴1h.标记后的PCR产物用QiaquickNucleotideRemovalKit纯化,去除未标记上的荧光染料,然后以0.1%的比例加入到用点样液溶解的DNA片段的溶液中,配制成样品液.1.2.4检测dna片段的制备取20μL样品液,转移到96孔V型底加样板中,制备好的基因片段用PixSysTMPA5500点样仪点样.每个样品重复4块载玻片,每片重复42个点.1.2.5洗脱液用量的确定点样后的载玻片先用ScanArrayLite扫描仪扫描,再经过水合(室温下湿盒中放置30min)、干燥(80℃烘干1h)、紫外交联(900mJ·cm-2,有或无)处理等步骤.然后依次用洗脱液1(2×SSC,0.1%SDS)、洗脱液2(0.1×SSC,0.1%SDS)、洗脱液3(0.1×SSC)各洗涤5min,双蒸水洗涤2次,每次5min,800r·min-1离心5min,37℃烘干1h.1.2.6测试使用ScanArrayLite扫描仪扫描,分辨率为5μm,激光强度为90%,使用AxSysTM软件进行分析.2紫外衔接对片段dna固定率的影响DNA固定率是评价基因芯片制备技术的重要指标,指基因芯片洗脱后,与基因芯片片基结合的DNA占总点样量的百分比.计算公式为:DNA固定率/%=(洗脱后荧光值/洗脱前荧光值)×100.从检测结果(表1)看,洗脱前背景大致相同,在26左右,说明片基表面均匀一致.洗脱后,荧光信号降低,荧光背景上升.对固定率进行t测验,结果表明:载玻片Ⅰ与载玻片Ⅱ没有明显差别,t=0.7228,t0.01=3.106,P>0.01;紫外交联对大片段DNA固定率的影响显著,t=63.247,t0.01=4.032,P<0.01;紫外交联对末端氨基修饰的寡核苷酸的固定效率影响非常小,t=1.1190,t0.01=4.032,P>0.01.洗脱前荧光信号以水作为点样液为最高,其次为MSS,然后是3×SSC,但后两者差别不大.此种点样液中,水的固定效率最高,其次是MSS,之后是3×SSC.表1和图1、2表明,紫外交联对大片段DNA的固定必不可少.表1和图3、4表明,对于氨基修饰的寡核苷酸,紫外交联的作用并不明显,在有或无紫外交联的情况下,氨基修饰的寡核苷酸都可以很好地固定在聚赖氨酸处理的载玻片上.这是因为氨基基团与聚赖氨酸的肽键相互作用而形成共价连接,该反应不需要紫外激发.3点样效果分析载玻片上常沾有灰尘和油脂类物质,导致包被不均匀和较高的荧光背景,因此在包被前一定要将载玻片彻底清洗干净.本试验所使用的清洗液洗涤效果很好,一般可以反复使用3-5次.但是该洗液极易氧化褐变,在室温条件下一般可以存放2d,4℃可以存放1周,-20℃可以存放1a以上.本研究使用的3种点样液中,以水作为点样液固定率最高.这是因为水的表面张力小,点容易扩散,造成其样点面积远大于盐溶液的样点面积,从而使DNA固定率提高.但由于其样点面积过大,不能用于制作高密度芯片,同时,由于水溶液均匀度差,点样效果不好.以MSS和3×SSC作点样液,两者在点的大小、形状和均匀度上没有明显区别,效果都比较好.但是前者的固定率略高于后者,同时,后者的上样量不如前者大(表1).其原因是3×SSC溶液表面张力大于MSS,在同样的点样参数下,3×SSC溶液上样量相对大一点.从固定率和样点的形状综合评价,3种点样液中,进口点样液点样效果最好,其次为3×SSC,之后是水.通过对氨基修饰的寡核苷酸和大片段DNA固定效率的比较研究,发现国产玻璃片与进口玻璃片没有明显差异,国产玻璃片可以用于制备DNA芯片.但是国产玻璃片的大小和厚度不均一,即使是同一型号