色谱分析-乙醇中微量水分测定

项目2.1乙醇中微量水分测定模块2：色谱分析任务引入课件决定让检测其中水分含量，并提交检测报告。★色谱分析基本原理★气相色谱仪的构造及使用方法★外标法定量分析方法任务分析完成乙醇中少量水分测定，需要具备的基本知识和基本技能任务资讯

制定检测方案

决策计划

实施样品检测任务实施

任务检查评价

检查评价获取相关知识乙醇中少量水分测定

什么是气相色谱法？任务资讯茨维特实验（动画茨维特实验.swf）色谱法由来色谱柱流动相固定相色谱法动画：步行上街任务资讯色谱法定义色谱分析法实质上是一种物理化学分离方法，即利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数（或吸附系数），当两相作相对运动时，这些物质在两相中反复多次分配（即组分在两相之间进行反复多次的吸附、脱附或溶解、挥发过程）从而使各物质得到完全分离。任务资讯色谱法发展历史1茨维特发现他的色谱法之后的20多年里，几乎无人问津这一技术。到了1931年，德籍奥地利化学家库恩（R.Kuhn）利用茨维特的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a和b两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。随后他还发现了八种新类胡萝卜素，并把它们制成纯品，进行了结构分析。同年，库恩又把注意力集中在维生素的研究上，确定了维生素A的结构。此外，他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确定离析出来并制成结晶。1933年库恩从35000升脱脂牛奶中分离出1g核黄素（即维生素B2），制得结晶，并测定了它的结构。任务资讯色谱法发展历史21938年，Kuhn因在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果被授予诺贝尔化学奖。从此色谱法开始为人们所重视，迅速为各国科学家们所注目，广泛被采用起来。此后，相继出现了各种色谱方法（如下表所示）。现在的色谱分析已经失去颜色的含义，只是沿用色谱这个名词。年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。任务资讯色谱法发展历史3年代发明者发明的色谱方法或重要应用1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。任务资讯

色谱法分类以气体为流动相气相色谱法(GC)气固色谱法(GSC)气液色谱法(GLC)以固体为固定相以液体为固定相以液体为流动相液相色谱法(LC)液固色谱法(LSC)液液色谱法(LLC)以固体为固定相以液体为固定相？1.按两相状态分任务资讯

色谱法分类固定相均为液体分配色谱：据不同组分在固定液中溶解度大小而分离气液色谱法液液色谱法固定相均为固体吸附色谱：据不同组分在吸附剂上的吸附和解析能力大小而分离气固色谱法液固色谱法2.按分离原理分任务资讯色谱法分类3.按固定相形式分柱色谱：填充柱色谱开管柱色谱（毛细管柱色谱）平板色谱：纸色谱薄层色谱离子交换色谱：利用离子交换剂与溶液中的离子之间发生交换反应进行分离的方法尺寸排阻色谱（凝胶色谱）：对高分子物质有很高的分离效果键合相色谱任务资讯纸色谱是以滤纸为载体，固定相是滤纸纤维上吸附的水分；流动相(通常称为展开剂)一般是指与水相混溶的有机溶剂，样品在固定相水与流动相展开剂之间连续抽提，依靠溶质在两相间的分配系数不同而达到分离的目的。任务资讯任务资讯薄层色谱（1）适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质（2）是柱色谱的先导（3）分类：吸附型（Al2O3、硅胶G等作吸附剂）分配型（硅藻土、纤维素等作支持剂）（4）定义：在洗涤干净的玻板（15×3cm）上均匀地涂上一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，晾干或吹干后，置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将板取出，干燥后喷以显色剂或在紫外灯下显色或直接观察。比移值Rf==任务资讯薄层层析硅胶薄层板点样展开显色任务资讯薄层色谱装置图任务资讯离子交换剂的种类强酸性阳离子交换树脂无机离子交换剂有机离子交换剂(离子交换树脂)特种树脂螯合树脂大孔树脂萃淋树脂纤维素交换剂负载螯合剂树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂弱酸性阳离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂R-SO3H树脂,如国产732R-COOH,R-OH树脂R4N+Cl-树脂任务资讯凝胶色谱法原理任务资讯键合相色谱法：是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。任务资讯如何使用气相色谱仪？任务资讯认识气相色谱仪任务资讯问题：气相色谱仪的基本组成？总结气相色谱仪的基本组成及作用（共由六大系统组成）气路系统。作用是提供连续运行且具有稳定流速与流量的载气与其它辅助气体。主要由钢瓶、减压阀、净化器、稳压阀、稳流阀等部件组成。进样系统。作用是将样品定量引入色谱系统，并使样品有效地气化，然后用载气将样品快速“扫入”色谱柱。主要包括进样器和气化室。分离系统。主要由柱箱和色谱柱组成，其中色谱柱是核心，主要作用是将多组分样品分离为单一组分的样品。任务资讯检测系统。其作用是将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于记录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量，是色谱仪的“眼睛”。主要有FID检测器与TCD检测器。数据处理系统。最基本的功能是将检测器输出的模拟信号随时间的变化曲线，即将色谱图绘制出来。目前使用较多的是色谱数据处理机与色谱工作站。温度控制系统。在气相色谱测定中，温度的控制（主要对色谱柱、气化室与检测器三处的温度进行控制）是重要的指标，它直接影响柱的分离效能、检测器的灵敏度和稳定性。总结气相色谱仪的基本组成（续）任务资讯程序升温恒温气化室温度比柱温高10~50℃检测器温度与柱温相同或略高于柱温；☆当被分析组分的沸点范围很宽时，用同一柱温往往造成低沸点组分分离不好，而高沸点组分峰形扁平，此时采用程序升温的办法就能使高沸点及低沸点组分都能获得满意结果。☆所谓程序升温就是指在一个分析周期里，色谱柱的温度连续的随分析时间的增加从低温升到高温，升温速率可为1～30℃/min。☆采用程序升温的方式可改善宽沸程样品的分离度并缩短分析时间。问题：气相色谱仪的分析流程？学生讨论、总结（动画：仪器分析流程）打开流动相气体(载气)开机，设置参数进样分析信号记录显示任务资讯

热导检测器（TCD）是利用被测组分和载气的导热系数不同而响应的浓度型检测器工作原理散热差异两臂电阻值差异电桥失去平衡信号输出输出的电压信号与样品的浓度或正比载气参比池试样测量池

TCD的结构和工作原理热导池外观动画热导检测器工作原理.swf任务资讯设置气化室温度、柱温和检测室温度打开钢瓶总压并调节减压阀调节载气柱前压打开色谱电源开关设置桥流待基线稳定即可进样开机步骤关机步骤设置桥流为零设置气化室温度、柱温和检测室温度为20℃待柱温降至50℃以下关闭电源开关关闭柱前压关闭钢瓶总阀，旋松减压阀

TCD操作实训动画热导池检测器的使用.swf任务资讯色谱图是色谱输出数据。如何“看”懂色谱图？如何从色谱图中获取相应检测结果的信息？任务资讯色谱流出曲线常用术语色谱流出曲线图保留值(定性分析参数)死时间保留时间调整保留时间色谱流出曲线基线色谱峰选择性因子相对保留值任务资讯色谱峰及相关术语峰宽w半峰宽w1/2

标准偏差峰面积A峰高h区域宽度定量数据参数注：任务资讯分配系数KK值与固定相和温度有关，K小的组分先流出柱，K大的组分后出柱。分配比k（分配容量比、容量因子）k值越大，保留时间越长。

β表示相比率，柱形特点参数。任务资讯任务资讯定性分析—保留值定量分析—峰高、峰面积定性分析的依据：保留值（tR或tR’）当我们得到一张色谱图，谱图中有多个色谱峰，我们怎么能够知道每个峰代表什么物质呢，这就是定性。从色谱图中我们可以知道每个色谱峰都有一个对应的保留时间，就是说不同的物质保留时间不同，之所以保留时间不同，主要是在于色谱柱的分离作用，由于不同物质与色谱柱中固定相的作用不同，而从色谱柱中流出快慢的因素。因此我们可以利用保留时间进行定性。定性分析任务资讯1.保留时间定性2.利用不同检测方法定性3.保留指数定性4.柱前或柱后化学反应定性5.与其他仪器联用定性任务资讯定性分析方法1.保留时间定性在一定的色谱系统和操作条件下，每种物质都有一定的保留时间，如果在相同色谱条件下，未知物的保留时间与标准物质相同，则可初步认为它们为同一物质。(见图示)为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件(分离柱、流动相、柱温等)或在样品中添加标准物质，如果被测物的保留时间仍然与标准物质一致，则可认为它们为同一物质。任务资讯1.保留时间定性用已知纯物质与未知样品对照比较进行定性分析图示a.甲醇峰；b.乙醇峰；c.正丙醇峰；d.正丁醇峰；e.正戊醇峰；1-9：未知物色谱峰任务资讯2.利用不同检测方法定性同一样品可以采用多种检测方法检测，如果待测组分和标准物在不同的检测器上有相同的响应行为，则可初步判断两者是同一种物质。在液相色谱中，还可通过二极管阵列检测器比较两个峰的紫外或可见光谱图。任务资讯3.保留指数定性在气相色谱中，可以利用文献中的保留指数数据定性。保留指数随温度的变化率还可用来判断化合物的类型，因为不同类型化合物的保留指数随温度的变化率不同。4.柱前或柱后化学反应定性一般不采用5.与其他仪器联用定性将具有定性能力的分析仪器如质谱(MS)、红外(IR)、原子吸收光谱(AAS)、原子发射光谱(AES，ICP-AES)等仪器作为色谱仪的检测器即可获得比较准确的定性信息。任务资讯定量分析的依据：峰高h，峰面积A色谱图A或h样品的量样品的量m∝A或h校正因子任务资讯定量分析的依据：被测组分的量与检测器的响应值成正比，也就是与它在色谱图上的峰面积或峰高成正比。

1.峰面积的计算2.定量校正因子3.定量计算方法任务资讯1.峰面积的计算(1)对称峰：（2）不对称峰：（3）色谱工作站：直接给出A、h、任务资讯引入定量校正因子的原因：我们知道，被测组分的量与它在色谱图上的峰面积或峰高成正比。但是，相同量的两种不同组分在同一检测器(例如紫外检测器)中的响应值并不相同，也就是两者的峰面积或峰高不相同。所以，两者的峰面积或峰高之比并不等于两者的含量之比。因此，需要引入定量校正因子，使峰面积或峰高经过校正后，与其代表物质的量相适应。2.定量校正因子任务资讯定量校正因子的定义：进入检测器的组分的量(W)与其色谱峰面积(A)或峰高(h)之比为一比例常数f′,该比例常数f′就称为该组分的绝对校正因子。W的单位校正因子名称符号质量(g)绝对质量校正因子物质的量(mol)绝对物质的量的校正因子体积(L/mL)绝对体积校正因子任务资讯相对校正因子：由于化合物的绝对校正因子难以测定，它随实验条件的变化而变化，故很少采用，实际工作中一般采用相对校正因子：某组分i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子之比。任务资讯获得校正因子的方法：一是查文献、手册获得；二是实验测定。因所用检测器类型和色谱条件与文献不同或者查不到，需自行测定。方法：一定量的待测物＋选定的基准物→制成一定浓度的混合溶液进样，测得两组分色谱峰面积Ai和As，由公式求得。注意事项：相对校正因子与待测物、基准物和检测器类型有关，与操作条件(进样量)无关。选取基准物的原则：与待测物保留时间比较接近；TCD→苯，FID→正庚烷。以氢气和氦气作载气的校正因子可通用；以氮气作载气测的校正因子与两者差别大。任务资讯请设计甲苯对苯相对校正因子的测定步骤并测定准确称取色谱纯（或已知准确含量）的被测组分和基准物质，配制成已知准确浓度的样品，在已定的色谱实验条件下，取一定体积的样品进样，准确测量所得组分和基准物质的色谱峰峰面积，根据计算公式就可以计算出该组分的相对校正因子。测定方法配制已知准确浓度的样品用色谱分析根据公式计算相对校正因子的测定任务资讯（1）外标法（2）内标法（3）面积归一化法（4）标准加入法3.定量计算方法任务资讯外标法提示：可以峰面积或峰高对组分浓度或体积绘制标准曲线。在可见分光光度法、原子吸收分光光度法中我们大家都学习过“标准曲线法”的相应知识与技能，我们先请一位同学起来简述一下其相应的测定过程。问题：能否将这种定量方法应用于气相色谱分析？比如测定乙醇中的微量水份。今天我们就一起来学习气相色谱分析中的“标准曲线法”，即外标法。任务资讯问题：能否配制相同浓度的标样，以不同体积进样，绘制A（h）～V曲线？标准曲线法也称外标法或直接比较法，它与可见分光光度法、原子吸收分光光度法中所学习过“标准曲线法”完全类似。外标工作曲线的绘制用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的色谱条件下，等体积准确进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准曲线，此标准曲线应通过原点。若标准曲线不通过原点，则说明存在系统误差。标准曲线的斜率即为绝对校正因子任务资讯以待测组分纯品为对照物，与试样中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。特点：①不需要校正因子，不需要所有组分出峰；②结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大。a.工作曲线法：纯品→工作曲线，同体积样品与之比较浓度c。前提是进入检测器样品量与峰面积成正比:A=kc(理想)；A=b+kc(实际)。b.外标一点法：一个标准溶液浓度对比样品中待测组分含量。前提是截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近c.外标二点法：用两个标准溶液代替标准系列。前提是选取两点对照品的浓度，需涵盖待测浓度。任务资讯mm标m样A样A标外标一点法定量示意图任务资讯查阅资料◆《仪器分析实验》中气象色谱分析乙醇中少量水的测定◆GB/T603化学试剂◆GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法决策计划决策计划外标工作曲线的绘制仪器开机，设置参数，调试。待仪器调试至基线平直后，进样绘制h～V工作曲线。标准溶液的配制测定样品溶液关机确定乙醇中少量水分的测定方法

质检员准备检测用仪器任务实施气相色谱仪；GDX-102不锈钢填充柱（柱长2m）；色谱工作站；微量注射器（1μL）一支/组；10mL比色管5支/组。质检员准备检测用试剂任务实施无水乙醇，在分析纯试剂无水乙醇中，加入500℃加热处理过的5A分子筛，密封放置1天，以除去试剂中的微量水分；三级蒸馏水；乙醇中少量水分检测任务实施配制标准系列溶液；2.开启色谱仪和色谱工作站；3.设置仪器条件TCD检测器，桥电流160mA；柱温140℃；气化室温度150℃；检测室温度140℃；H2作载气，流速30mL/min；进样量1μL。4.定量测定；有计算机调出色谱操作系统，按照要求进行界面设定。极限稳定后，依次注射标准样品和待测样品（重复进样3次），由工作站给出相应组分的A或h。5.结束工作。依次关闭热导池电流开关、操作系统恢复初始温度，冷却后关主机，关载气。实验结束后清洗注射器，清理台面，填写仪器使用记录。6.根据标样浓度与相应的峰面积绘制工作曲线；7.根据试样中水的峰面积在标准曲线中查出乙醇试样中水的浓度（mg/mL），并写出检测报告。■仪器规范使用方面■数据记录、计算方面■结果准确度、精密度方面■误差原因分析检查与评价前提是试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰；依据是组分含量与峰面积成正比。优点：简便，准确，色谱条件略有变化对结果几乎无影响，定量结果与进样量、重复性无关。缺点：必须已知所有组分的校正因子，不适合微量组分的测定。归一化法测丁醇异构体(动画)面积归一化法：任务引领下的知识拓展与深化

AB

CD

请仔细观察右面的4个色谱分离图，并指出其中哪一个分离效果最佳？说出你的理由。从色谱图上观察，你认为相邻谱峰分离效果的优劣与哪些因素有关？保留值差值峰宽任务引领下的知识拓展与深化

问题：如何进行分离条件的选择与优化？讨论（可从下列2个方面入手）两相邻色谱峰的距离，越大则分离越好；色谱峰的峰形，越尖锐或对称则分离越好。

总结2种情况的核心基于保留时间的差值；基于色谱峰的峰宽与对称度。

任务引领下的知识拓展与深化

分离度R是色谱柱总分离效能指标。分离度RR值越大，两相邻组分分离越完全；R=1.5，两相邻组分分离程度99.7%；R=1，两相邻组分分离程度98%；R＜1，两相邻色谱峰有明显重叠；通常用R≥1.5作为相邻两峰完全分离的指标。任务引领下的知识拓展与深化

保留值差值——色谱热力学因素影响分离度R的主要因素峰宽——色谱动力学因素反映了试样中各组分在色谱柱中的运动况；与各组分在两相间的传质阻力有关。速率理论任务引领下的知识拓展与深化

塔板理论反映了试样中各组分在两相间的分配情况；与各组分在两相间的分配系数有关；与各物质(组分、固定相、流动相)的分子结构与性质有关。

塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；

塔板理论-柱分离效能指标任务引领下的知识拓展与深化

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!任务引领下的知识拓展与深化

有效塔板数和有效塔板高度

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：任务引领下的知识拓展与深化

塔板理论的特点和不足(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。任务引领下的知识拓展与深化

速率理论色谱峰在分离过程中为什么会扩展？A涡流扩散(固定相)B分子扩散（流动相）C传质阻力（两相间的相对运动）范第姆特方程：任务引领下的知识拓展与深化

涡流扩散（动画涡流扩散过程.swf）A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径；λ：固定相的填充不均匀因子。

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑，则涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰变窄。任务引领下的知识拓展与深化

分子扩散（动画分子扩散过程.swf）B