微生物的培养技术及应用课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

微生物的培养技术及应用

01微生物的基本培养技术WEISHENGWUDEJIBENPEIYANGJISHU传统发酵技术的缺点

菌种差异、杂菌情况不明、发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。

为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大规模生产时，通常先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵。

防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。在实验室培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。（一）微生物难以用肉眼观察的微小生物的统称。1.概念2.微生物的类群（1）无细胞结构（2）原核细胞（3）真核细胞病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌：链霉菌等真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等3.微生物的结构（一）微生物直径在30～200nm之间直径在0.5～5μm之间直径3～6μm之间～～~

微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想看某种纯净的微生物。我们该怎么做？若想通过肉眼能看到细菌，我们又该如何？

必须对其进行分离纯化；

对微生物进行大量培养，致使其在培养基表面或内部形成菌落。不同的细菌具有不同的菌落。

分散的微生物在适宜的琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。沙门氏菌毛霉菌落是鉴定菌种的重要依据（一）微生物2.实验室培养微生物条件（1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件。——培养基（2）确保其它微生物无法混入。——无菌技术（二）培养基的配制2.作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。1.培养基的概念培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。固体培养基液体培养基有无琼脂长有酵母菌菌落盛有液体培养基分离、计数、鉴定、保藏等扩大培养、用于工业生产特别提醒(1)固体培养基中的琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源。(2)病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。（二）培养基的配制3.基本成分水、碳源、氮源和无机盐①

碳源无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-等有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等自养微生物异养微生物②

氮源无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源③

无机盐Ca、K、Mg等为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等为微量元素*一般情况下，不添加氮源培养基可用来培养_____微生物固氮补充说明：①

含有C、H、O、N的有机物可作为异养型微生物的碳源、氮源、能源。②

自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳源。③

自养型微生物所需的碳源来自无机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源，因此可以根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。④

无机氮源不但能给自养型微生物提供氮源，也能作为能源物质，如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源（NH3氧化释放的化学能）。⑤

无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）。旁栏思考题：

为什么培养基需要氮源？

培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。（二）培养基的配制4.培养基的营养构成表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水

牛肉膏和蛋白胨来源与动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。牛肉膏蛋白胨培养基

是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基（二）培养基的配制5.培养基的特殊需求

在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对___、____________以及___的需求；pH特殊营养物质O2微生物例子培养基需要的特殊物质或条件

乳酸杆菌霉菌细菌厌氧微生物添加维生素调至酸性调至中性或弱碱性提供无氧的条件维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等划分培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定。微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物。在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基（二）培养基的配制4.培养基的类型配制培养基根据成分划分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基(1)合成培养基：培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。如察氏培养基等。(2)天然培养基：由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤。(3)半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分。

1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。1、实例：

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。寻找耐高温的DNA聚合酶

筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。选择培养基美国黄石公园培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌选择培养基培养基+氨苄青霉素培养基

没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌?具体处理原理目的选择培养基加入青霉素青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用加入高浓度食盐金黄色葡萄球菌耐高盐不加氮源固氮微生物能利用空气中的氮气不加有机碳源自养型微生物能利用无机碳源鉴别培养基加入酚红培养基尿素被分解产生氨，培养基呈碱性，酚红指示剂变红。加入刚果红刚果红与纤维素能形成红色复合物，当纤维素被分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以菌落为中心的透明圈。拓展练习：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养微生物鉴别分解尿素的细菌鉴别纤维素分解菌分离金黄色葡萄球菌金属光泽的紫黑色1、大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征

2、纤维素分解菌在刚果红培养基上典型特征

红色消失，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈鉴别培养基：2.几种微生物的营养和能量来源微生物碳源氮源能源蓝细菌CO2光能硝化细菌CO2NH3NH3的氧化根瘤菌糖类等有机物N2有机物大肠杆菌糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物（二）培养基的配制

原则①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。细菌pH为：；放线菌pH为：；真菌pH为：思考：

是否所有培养基都必须添加碳源、氮源？不是；

例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利用空气中的氮气。(1)用于发酵的微生物主要指细菌和真菌(

)(2)培养基中加入琼脂的目的是提供碳源(

)(3)所有微生物在培养时，培养基中都需加入氮源(

)(4)培养不同微生物的培养基成分完全一样(

)判断正误√×××【基础过关】(1)所有的培养基中都要加入琼脂。()(2)是碳源的物质不可能同时是氮源。(

)(3)培养霉菌时一般需将培养基调至碱性。(

)(4)培养厌氧型微生物时，除需要提供无机碳源之外，还需要提供无氧的条件。(

)××××(5)凡碳源都提供能量。（）(6)除水以外的无机物只提供无机盐。（）(7)无机氮源也可能提供能量。（）(8)培养基只能用于培养微生物。（）××√×提示：培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件，其碳源的类型要看其同化作用类型，若为自养型则需要提供无机碳源，若为异养型则需要提供有机碳源。【典例】下表是牛肉膏蛋白胨培养基的配方，分析回答：注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质.材料牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水用量5g10g5g20g定容至1000mL(1)根据培养基的物理性质，该培养基属于________培养基，理由是_____________________________________________________________。(2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？________________________________________________________。(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是_____________，理由是_________________________________________________________。固体该培养基的配方中含有凝固剂琼脂牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均属于有机物异养型微生物该微生物的碳源和氮源是有机物探讨点概述培养基的种类和营养构成资料一：配制培养酵母菌的培养基：称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL。资料二：100g马铃薯中含有80g水、2g蛋白质、16g碳水化合物，还有维生素、无机盐等。核心探讨突破重难强化素养结合提供的资料和教材中的“表1－1

1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析并回答下列问题：1.按物理性质划分上述两种培养微生物的培养基的种类。提示由于琼脂是凝固剂，所以培养酵母菌的培养基是固体培养基，而牛肉膏蛋白胨培养基未加凝固剂，是液体培养基。2.分析上述两种培养微生物的培养基的营养构成。提示都含有水、碳源、氮源、无机盐和维生素等，其中培养酵母菌的培养基中主要由糖类提供碳源，蛋白质提供氮源，牛肉膏蛋白胨培养基中主要由牛肉膏提供碳源，主要由蛋白胨提供氮源。4.下表是某微生物培养基的成分，请分析该培养基可用来培养哪种微生物？若除去①，此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？编号①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100mL提示此培养基可用来培养自养型微生物。圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。1.关于微生物的营养，下列说法正确的是A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源B.凡是碳源都能提供能量C.除水以外的无机物仅提供无机盐D.无机氮源也可能提供能量典题应用及时反馈知识落实√2.下列有关培养基的叙述，正确的是A.微生物的培养都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可B.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性D.培养基只能培养细菌√（三）无菌技术1.获得纯净的微生物培养物的关键：______________2.无菌技术应围绕________________展开，主要包括消毒和灭菌。*①对操作的____、操作者的____和____进行_____和_____；②对用于微生物培养的_____、________和______等进行_____；*做好消毒灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。*为避免周围环境中微生物的污染，许多操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。防止杂菌污染如何避免杂菌的污染空间衣着手清洁消毒器皿接种用具培养基灭菌思考：

无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。2.常用的消毒和灭菌方法（1）消毒①

概念

使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。类型适用范围操作方法消毒较为温和理化生方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）。煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s～1min化学药物生物活体、水源等用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线照射紫外线照射30min接种室、接种箱，超净工作台。②

常用的消毒方法损失细菌DNA资料卡无菌技术（AsepticTechnique）煮沸消毒巴氏消毒紫外线消毒化学药剂消毒2.常用的消毒和灭菌方法（2）灭菌①概念

指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。②灭菌的方法湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌①芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。②孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。

（2）灭菌原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。对象：培养基等注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15～30min。高压蒸汽灭菌锅2.常用的消毒和灭菌方法操作步骤操作要领加水将内层灭菌桶取出，向外层锅内加水，水面与三角形搁架平齐装锅将灭菌物品放在灭菌桶中(不要装得太满)，加盖，对称固定螺栓加热排气加热灭菌锅，打开排气阀，等冷空气完全排尽后，关闭排气阀保温保压100kPa、121℃下，保温保压15～30min出锅1.关闭电源2.压力表降至“0”点，（温度下降）打开排气阀，3.旋开固定螺栓，取出灭菌物品高压蒸汽灭菌法（最常用）：培养基、玻璃器皿、工作服等（2）灭菌原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和

原生质干燥等。对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于

玻璃器皿

(如试管、培养皿、吸管、注射器)

金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌。②干热灭菌：干热灭菌箱内160～170℃下加热2～3h。2.常用的消毒和灭菌方法干热灭菌箱类型适用范围操作方法灭菌强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）。灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃,15～30min。常用的灭菌方法（小结）（2）灭菌③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧效果：最彻底原理：使微生物燃烧对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。2.常用的消毒和灭菌方法针对不耐高温的液体接种室、超净工作台培养皿.吸管等玻璃器皿耐高温、需保持干燥接种环等金属工具实验操作者的双手培养基家庭餐具等生活用品消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法c.化学药剂d.紫外线e.灼烧灭菌f.干热灭菌g.高压蒸汽灭菌bdecagf(1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染(

)(2)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底(

)(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用干热灭菌法进行灭菌(

)判断正误√√×3.下列有关无菌技术的说法，正确的是A.无菌技术的关键是杀灭实验室中的所有的微生物B.培养微生物的试剂和器具都要进行湿热灭菌C.经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭，不能在常温下长期

保存D.无菌技术中，若处理对象为液体，则只能消毒，不能灭菌典题应用及时反馈知识落实√√（三）微生物的纯培养

由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。1.概念2.步骤配制培养基灭菌接种分离培养等酵母菌的纯培养

分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。微生物群分散或稀释单个细胞繁殖单菌落酵母菌的纯培养

目的要求

1.学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。2.学会进行无菌操作。3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。

材料用具

酵母菌培养液、马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、蒸馏水、天平、小刀、纱布、烧杯、锥形瓶、棉塞、牛皮纸(或报纸)、皮筋、培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱和恒温培养箱等。2.步骤（1）制备培养基配制培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。灭菌

将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。倒平板待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。调pH倒平板倒平板的具体操作步骤④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置①拔出锥形瓶的棉塞②将瓶口迅速通过火焰③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10-20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。（2）接种和分离酵母菌

通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。连续划线法分区划线法平板划线的具体操作步骤①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞。③将试管口通过火焰④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液。⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。平板划线的具体操作步骤12345灼烧接种环蘸取菌液第1区接种灼烧接种环第2区接种灼烧接种环第3区接种第5区接种注意：①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次。②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌④划线后,培养皿底部做好标记，培养皿倒置培养。酵母菌的纯培养

3.培养酵母菌完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃

左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。酵母菌的纯培养结果分析与评价1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有,说明了什么?2.在接种酵母菌的培养基上,你是否观察到了单菌落?这些菌落的颜色、形状和大小是否一致?如果你观察到了不同形态的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的吗?3.你是如何记录实验结果的?请与其他同学交流、互评。提示1：在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。提示2：如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或无菌操作不规范等原因引起的。（四）实验注意事项、分析、思考1.培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？2.为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？3.倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？4.在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

琼脂是一种多糖，在44℃以下凝固，倒平板时，若低于50℃不及时操作，琼脂会凝固。避免杂菌污染

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

不能；因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。5.为什么倒平板时，将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能完全打开？6.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？7.怎么确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？8.未接种的培养基直接培养起什么作用？防止杂菌污染培养基

可避免培养基中的水分过快蒸发；可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。

做空白对照，若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。9.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？10.为什么在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线