免疫学终结版

免疫学在食品分析中的应用基础知识免疫学：研究自身防御，机体如何识别异物并与之发生反应的一门科学，它在生长、遗传、衰老、肿瘤、移植以及自身免疫病的发生上都有重要的作用。

免疫（Immunity）：指生物机体识别自身和非自身物质，对自身物质形成天然免疫耐受，对非自身物质产生清除作用的一种生理学反应。近年来,国内外许多专家学者致力于食品检验方法的研究,出现了许多快速检验新技术,如免疫技术包括:酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、免疫传感器、阻抗测量法、生物发光法与化学发光法、荧光免疫测定、金黄色葡萄球菌A蛋白及其协同凝集试验,核酸探针、磁性分离技术等。4主要内容3：

免疫荧光技术1酶联免疫吸附测定技术2放射免疫技术(RIA)3单克隆抗体技术4一.免疫荧光技术（一）基本原理：抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固定于载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，否则荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下观察不到荧光。（二）抗体的荧光标记：荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物,也称荧光色素。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。

异硫氰酸荧光素(FITC)荧光素与抗体结合方法：

⑴透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记

②标记较均匀，非特异荧光较低

⑵搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品体积较大的抗体溶液的标记

②标记时间短、效率较高，荧光素用量节省

③影响因素多，非特异荧光较强（三）标本的制作：食品卫生检验中，荧光标记抗体检测标本的制作方法是将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色。直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。（四）荧光抗体染色方法间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

间接荧光抗体染色法示图抗原抗体标记抗体光原荧光补体结合法

两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。抗体补体标记抗补体抗体光源荧光（五）在食品检验中的应用免疫荧光检测技术已经广泛应用于医药卫生领域，可检测细菌、病毒、寄生虫等，在食品卫生领域也应用得越来越多。二.酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定（ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。基本原理：它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）

测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。

其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。

这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。

其方法简单，方便讯速，特异性强。

间接法双抗体夹心法捕获法竞争法ELISA常用的操作方法间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗体IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点

一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。应用

常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。ELISA检测抗体的方法1、已知抗原吸3、加酶标抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗体吸2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色。应用：

二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗体的方法竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测。ELISA检测抗体的方法捕获法原理：抗人IgMμ链抗体包被，捕获待测标本中IgM类抗体。加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体，底物显色。应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体，甲型肝炎HAV-IgM抗体，乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体。ELISA检测抗体的方法ELISA法在食品安全检测中的应用1.动物性食品中药物残留检测近年来动物性食品药物残留问题更加突出。食品中兽药残留主要包括抗生素类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫类、激素药类和驱虫药类药物。目前国内应用ELISA技术检测药物残留研究取得较大进展。瘦肉精是现在肉制品中的一种常见的添加剂,可致癌变或直接影响人体健康,是一种β2-肾上激素受体激动剂,化学名为盐酸克伦特罗。ELISA法应用于瘦肉精检测灵敏度高,成本低,前处理简单且快速。2.食品中农药残留的测定农药残留是指农药使用后残存于食品(农副产品)中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。目前，农残已成为我国人民膳食的主要食品安全问题，也是影响我国农产品出口的一个重要因素。可用ELISA检测的农药残留种类包括:1.有机磷农药2.拟除虫菊酯类农药3.有机氯类农药。3.食品中生物毒素的检测生物毒素是其产生菌在适合产毒的条件下所产生的次生代谢产物。在食品加工时虽然经加热、烹调等热处理,但所产生的毒素结构一般不能被破坏,所以食品中生物毒素也日益受到关注。黄曲霉毒素是一种致毒性和致癌性很强的真菌毒素,各国都严格限制其在食品中的含量。1977年,LaWell首次采用了ELISA法来检测黄曲霉毒素，建立了直接竞争ELISA法检测黄曲霉毒素B1。随后,美国学者朱繁生教授、英国学者Morge教授改进了直接法并建立了间接竞争ELISA法。4.食品中病原微生物的检测食品安全问题中,首要问题是微生物污染。检测微生物的方法很多,常规的微生物学检验方法试剂繁杂、检验周期长,远不能适应实际需要,而ELISA法很好的弥补了这一缺陷,用ELISA法可检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌等微生物,其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多,检测结果准确可靠。5.转基因食品的检测转基因食品的安全性是最近有关食品安全性研讨的热点。由于其安全性还在争议之中,许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。这就需要对转基因食品进行检测。ELISA法就是通过检测某些特定的转基因表达蛋白,以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分,或间接检测转基因表达的目的蛋白质。ELISA试剂盒三.放射免疫技术(RIA)基本原理：

应用放射性同位素标记待测物，形成标记抗原。以一定量的标记抗原，与各种不同量的非标记待测物和一定浓度的特异性抗待测物抗体相互作用，其反应遵照质量作用定律，标记待测物与非标记待测物竞争抗待测物抗体的结合部位，产生不同的结合率。当标记的待测物与抗待测物抗体的量保持一定时，则标记的待测物与抗待测物抗体形成的复合物的多少就反映了待检物的含量。放射性同位素标记的抗原高质量的特异性抗体高纯度的标准品缓冲液放射免疫分析的必备条件Diagram固相放射免疫测定1.抗体的包被2.抗原抗体反应。3.B、F分离。4.放射性强度的测定。液相放射免疫测定1.抗原抗体反应2.B、F分离技术3.放射性强度的测定。放射免疫测定法放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫法分析由于灵敏度高，特异性强，精密度高，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，对水产品、肉类产品、果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。还可检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫及小分子物质和大分子物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。四.单克隆抗体基本原理：单克隆抗体技术是应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。单克隆抗体制备的简易过程过程B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞选择培养杂交瘤细胞（B-瘤细胞）克隆化培养抗体检测杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体单克隆抗体在食品检测中的应用单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强，不易出现假阳性。在食品检测中有广泛的应用前景。目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、兽药、激素等的单克隆抗体并建立的检测方法。磺胺二甲嘧啶和克伦特罗(瘦肉精)这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点，国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。单克隆抗体技术可对农产品中农药和激素残留快速检测，在10min中内快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类及激素类的残留量。参考文献[1]任亚妮,车振明.免疫标记技术在食品安全检测中的应用[J].中国调味品,2010,03:34-36.[2]韩婷,陈红兵.免疫分析技术在食品农残药残检测方面的应用[J].江西食品工业,2008,03:32-34.[3]李军生,叶云,梁超香,何仁.免疫检测技术在食品检验中的应用[J].广西工学院学报,2005,01:23-26.[4]洪葵.免疫学技术及其在食品中的应用[J].食品科学,1996,12:3-6.[5]郎需龙,刘文森,王兴龙.免疫学技术在食品安全检测中的应用[J].肉类工业,2009,05:33-35.[6]肖韡,买娜,王旭峰,常铮.酶联免疫吸附法在植物性食品安全检测中的应用[J].食品科学,2006,12:920-923.[7]马颀,任珊,许美玉.酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用[J].食品科技,2008,01:200-204.[8]彩鸿翔,鲁晓翠,侯玉泽,李卓洋,刘宣兵.酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用研究进展[J].河北农业科学,2007,06:67-69.[9]邱伟芬.酶联免疫吸附分析及其在食品安全