生物化学教学课件：protein engineering蛋白质工程

第十七章基因工程和蛋白质工程

1第三节蛋白质工程概念：重点一般技术；应用示例2*蛋白质的广泛功能

酶的催化作用:SOD,植酸酶,酪氨酸酶,角蛋白酶,凝血酶，溶菌酶信号传递：膜受体蛋白把信号传入细胞内部。转运与贮存:血红蛋白在血液中转运氧、铁蛋白在肝脏内贮存铁。结构与运动:

皮肤：胶原和角蛋白肌肉纤维:肌动蛋白和肌球蛋白3蛋白质的广泛功能

营养:

酪蛋白和卵清蛋白为生长提供氨基酸。免疫：免疫系统抗体蛋白抵御感染。调节：转录因子结合并调节其他分子（如DNA）。细胞质量控制：钙粘蛋白，HSP多功能：胶原蛋白（结构+抗原），血清白蛋白（促进血细胞）其它：生长激素、alpha-乳白蛋白、卵黄高磷蛋白、脂质转移蛋白4蛋白质结构氨基酸结构（通式）

：20种常见的氨基酸一个与质子、氨基、羧基相连的手性α－碳原子一条具有不同的理化特性的侧链。5非极性带电荷20种常见氨基酸结构不带电的极性不带电的极性芳香族6一、蛋白质工程的概念概念：489页从蛋白质的结构与功能的关系出发，从改造基因入手一方面定做新的蛋白质另一方面定向地改造天然蛋白质的结构，制造新型蛋白质7二、蛋白质工程的一般技术理论设计；定点突变技术；盒式突变技术；8三、蛋白质工程的应用示例枯草杆菌蛋白酶洗衣粉的添加酶制剂工业酶制剂中市场最大

枯草杆菌蛋白酶活性中心构造图增强抗氧化性？理论设计：改进Met2229增强抗氧化性的定点突变单点突变枯草杆菌蛋白酶与野生型的比活比较222位氨基酸对于野生型的相对比活(％)222位氨基酸对于野生型的相对比活(％)Cys138(稳定≺10分)Gln7.2Met(野生型)100(稳定≺10分)Phe4.9Ala53.0(稳定≻1Hr)Trp4.8Ser35.0Asp4.1Gly30.0Tyr4.0Thr28.0His4.0Asn15.0Glu3.6Pro13.0Ile2.2Leu12.0Arg0.5Val9.3Lys0.310蛋白质的跨膜转导能力的改进11跨膜转导肽的盒式突变技术12TAT-GFP细胞实验结果TAT-GFPGFP13MDCK细胞，样品组样品是效价为275U/ml的PTD－SOD发酵液正常组样品辐射组辐射组正常组样品辐射组辐射组HepG2细胞，样品组样品是效价为333U/ml的PTD－SOD发酵液。P<0.01TAT-SOD的Hep-G2细胞保护14TAT-SOD对Hep-G2细胞修复图无辐射对照修复组辐射对照UVC剂量达到细胞致死率为50％，PTD-SOD样品浓度为400U/ml。15溶菌酶的蛋白质工程溶菌酶飘带示意图。中间的圆形代表由Thr40,Ile55和Ser91等构成疏水中心.革兰氏阴性菌的膜结构示意图16通过蛋白质工程对溶菌酶的改造热稳定性的提高

加强疏水中心：S91T点突变，引进糖链抗菌范围的扩大融合疏水性短肽片断

17Asn19-Tyr20-Arg21Asn19-Tyr20-Thr21Gly49-Ser50-Thr51Asn49-Ser50-Thr51R21T19位和49位氨基酸突变而糖基化的溶菌酶18020406080100oligo-Lzpoly-LzwildTEMPERATURE(°C)RESIDUALACTIVITY(%)5060708090Figure2.ThermalStabilityofGlycosylated

Lysozyme(G49N)◆Wildlysozyme;▲,

oligomannosyl

lysozyme;

polymannosyl

100duringHeatingat50to95℃,195060708090Temperature(oC)02.01.61.20.80.4Absorbanceat500nmwildlysozyme

PolymannosylHeat-stabilityofpolymannosyl

lysozyme200.00.51.01.52.00123510TIME

(min)TURBIDITY

OF

EMULSION

(OD500)

polymannosyl

lys.oligomannosyl

lys.Commercial

Emulsifiers

(

Q-18,

SE-11)□Figure

3.

Emulsifying

Properties

of

oligomannosyl

and

polymannosyl

lysozymes.wild21融合疏水性短肽片断的溶菌酶2223020406080100120024681012(%)濃度(µg)WildH3H5H7不同长度的肽片段融合的溶菌酶的抗菌性大腸菌生存率24导入溶菌酶基因的烟草对灰霉病的抵抗性

导入溶菌酶基因的烟草对霜霉病的抵抗性25半胱氨酸蛋白酶抑制剂的蛋白质工程WildtypeI66QCystatin:半胱氨酸蛋白酶抑制剂Amyloidosis:淀粉样贮积症26Thethree-dimentionalstructureofchickencystatin,domain-swappingandamyloidformationmechanism.「71形成机理DomainSwappingDimerCAA（Ile）CAG(Gln)…GAGATTGGT…monomerdimerizationAmyloidfibrilformation27Fig.

ContructionofglycosylatedrecombinantchickencystatinmutantI108TI108T28Fig.Proposalstoexplainhowglycosylationaffectthefibrillizationmechan