不同溶出介质中熟大黄的体外溶出比较

不同溶出介质中熟大黄的体外溶出比较

中医药剂量-反应关系的研究是确保中医药临床疗效的基础和前提。然而,一定剂量下中药效应的发挥必须依赖于活性成分在体内的溶出、吸收状况,对于难溶性药效组分,其溶出是吸收的限速过程,溶出速度的快慢将直接影响到药物的生物利用度。因此,了解不同溶出介质下有效成分的溶出特性,对于客观准确评价药物疗效具有现实意义。大黄是临床常用的大宗药材,常以提取物使用。然而,在药典收载的大黄复方大黄蛰虫丸中,大黄以其炮制品熟大黄生粉直接入药。体内不同部位其溶出环境往往不同,相同剂量条件下,熟大黄在体内的溶出特性可能不尽相同。为此,笔者以熟大黄为研究对象,考察其在4种不同溶出介质中鞣质和蒽醌类成分的溶出量差异,从体外溶出的角度探讨影响中药量-效关系的可能因素,为进一步研究体内吸收代谢提供参考。仪器和试剂盒1.药品、成分配比及色谱检定所大黄购于甘肃礼县,经解放军302医院肖小河研究员鉴定为掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根及根茎。对照品大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素、没食子酸、儿茶素、表儿茶素购自中国药品生物制品检定所(批号分别为110795-200505、110796-200716、110757-200206、110758-200610、110799-200806、110725-200608、877-200001、110878-200102),甲醇(分析纯及色谱纯,由北京泰博昌生物技术有限公司提供)。其余试剂均为分析纯。方法1.细粉的制备取生大黄1kg,至煮制容器内,用300g黄酒拌匀,闷约1-2h至酒被洗净,装入炖药罐内,密闭,隔水炖约24-32h,至大黄内外均呈黑色时,取出,真空干燥,粉碎成细粉(100目)备用。2.对照品溶液的制备分别精密称取大黄素等5种蒽醌对照品适量,加甲醇分别制成每1mL含芦荟大黄素、大黄素、大黄酚各80μg,大黄酸、大黄素甲醚20μg的储备液,该储备液在4℃避光冷藏可稳定保存2个月以上。分别精密量取上述对照品储备液适量,置于同一量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,混匀,即得1mL中含芦荟大黄素(aloeemodin)、大黄酸(rhein)、大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素甲醚(physcin)各3μg。分别精密称取没食子酸(gallicacid)、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)对照品适量,加50%甲醇-水制成每1mL含没食子酸、儿茶素各200μg,表儿茶素100μg的储备液,分别再精密量取上述对照品储备液适量,用50%甲醇-水制成每1mL含没食子酸20μg,含儿茶素80μg,含表儿茶素50μg的鞣质类混合对照品液。3.色谱及色谱柱的制备取熟大黄约3g,精密称定,采用药典浆法,分别以pH1.2人工胃液、pH6.8(相当于小肠液pH值)人工肠液、pH7.0脱气水和pH8.34(相当于大肠液pH值)磷酸盐缓冲液为溶出介质,温度37℃,转速50r/min,分别于5、10、30、60、90、180、360min取样10mL,补加等体积等温脱气的溶出介质,取2mL样品用0.22μm的微孔滤膜过滤,取滤过液测定蒽醌及鞣质类成分的直接溶出量;剩余8mL+8%HCl8mL于120℃油浴锅上加热回流1h,放冷,取1mL用0.22μm的微孔滤膜过滤,取滤过液测定鞣质类成分水解后的含量,剩余15mL至分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗涤容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷层,酸液再用三氯甲烷提取3次,至三氯甲烷无色,每次10mL,合并三氯甲烷液,减压回收溶剂至干,残渣用2mL甲醇充分溶解,用0.22μm的微孔滤膜过滤,测定蒽醌成分萃取后的含量。色谱柱:WatersAcquityBEHC18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7µm),柱温35℃。流动相组成:流动相A:0.1%磷酸-水,流动相B:甲醇,线性梯度洗脱程序:0-1.5min,100%A;1.5-2.0min,100%-95%A;2.0-3.5min,95%-86%A;3.5-5.0min,86%-72%A;5.0-8.0min,72%-64%A;8.0-10.0min,64%-52%A;10.0-13.0min,52%-30%A;13-16.0min,30%-16%A。流速0.75mL/min,检测波长254nm;进样量5μL;理论塔板数按大黄素计算,应不低于3000。鞣质类成分在不同介质中的溶出差异大黄各标准品及样品液UPLC相色谱图,见图1。由图1可知,大黄鞣质和蒽醌类成分在液相上能较好的分开。为便于评价溶出样品各成分的变化关系,故在预实验中对比研究了生大黄与熟大黄化学成分的差异。发现,生大黄炮制成熟大黄后,已检测不到儿茶素,这一结果与文献报道一致,因此,本研究以没食子酸为代表来评价鞣质类成分在不同介质中的溶出差异。鞣质类成分(以没食子酸为指标)在4种不同溶出介质中溶出速度存在差异(见表1-表2),在pH8.34的磷酸盐缓冲液中溶出最快,30min即达到最大溶出,达到最大溶出先后顺序为:pH8.34>pH6.8>Water≈Pepsin(人工胃液);但鞣质类成分在不同介质中溶出量差异不明显。3.芦荟大黄素、大黄素、小黄素、小黄素甲醚检测大黄直接溶出后,5种游离蒽醌中仅大黄酸在pH8.34磷酸盐缓冲液和pH6.8人工肠液中能检测到,而芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚几乎检测不到。同时,从表3可看出,大黄酸在pH8.34磷酸盐缓冲液中的溶出量除10min取样点处低于pH6.8人工肠液中的溶出量外,其他各取样点均高于在人工肠液中的溶出量,考虑到大黄酸为酚酸类物质,具有一定的弱酸性,因此在偏碱性的溶出介质中溶出较多。4.不同介质中中各个衍生物体含量的变化游离蒽醌衍生物为脂溶性物质,在水中的溶解度极小,因此,直接溶出的蒽醌类物质主要是结合蒽醌。笔者所测5种蒽醌衍生物主要由结合蒽醌水解生成,故水解后测得不同时间点蒽醌衍生物含量越高,结合蒽醌在4种溶出介质中溶出量越多,溶出速度越快。5种蒽醌衍生物在不同溶出介质中的含量见图2。总体而言,5种蒽醌衍生物60min后,在各溶出介质中含量基本达到最高,同时,由于蒽醌类成分具有一定的弱酸性,在酸性的人工胃液中溶出最慢,且溶出量最少,具体到每个蒽醌衍生物体,其含量存在一定差异,总结如下:(1)芦荟大黄素在pH8.34磷酸盐缓冲液中含量最高,90min前在pH6.8人工小肠液中的含量高于在水中的含量,之后含量下降,但在180min后含量还在继续增加;(2)大黄酸含量在不同溶出介质中存在一定规律,即介质pH值越大,含量越高,含量顺序为:pH8.34>Water>pH6.8>Pepsin。另外,与直接溶出测得溶出量比较,大黄酸水解后在pH8.34和pH6.8的介质中含量均增加;(3)大黄素在pH8.34和脱气水中含量相对较低,在180min时含量仍在继续增加,在pH6.8人工肠液中,60min前大黄素含量已达到最大,之后含量开始下降,但仍高于在人工胃液中各点的含量;(4)大黄酚在各介质中含量大小的总体趋势为:Water>pH8.34>pH6.8>Pepsin;(5)大黄素甲醚的含量变化情况与大黄酚类似,只是含量较低。由图2可以看出,水解后5种蒽醌在60min(1h)时含量基本达到最高,故笔者以1h内5种蒽醌含量变化为指标,评价各成分所对应的结合蒽醌在不同介质中的溶出快慢:大黄素甲醚在各介质中含量变化最慢,其次是大黄素,而同一蒽醌衍生物在pH1.2人工胃液中含量变化最慢,在pH8.34磷酸盐缓冲液、pH6.8人工肠液和pH7.0水中含量变化相对较快,提示蒽醌类成分(主要指结合型蒽醌)在小肠和大肠处溶出可能快于在胃里的溶出,同时,大黄素和大黄素甲醚所对应的结合蒽醌在不同介质中的溶出较慢。不同药物中不同溶出性质的比较大黄在我国应用历史悠久,疗效广泛,具有泻热通肠,凉血解毒,逐瘀通经的功效。临床主要以生大黄和制大黄入药,而制大黄中以熟大黄应用较多,如大黄蛰虫丸、新清宁片、羚羊清肺丸等常用复方中均用熟大黄且多以原粉直接入药。研究熟大黄的溶出特性对评估药物吸收情况有重要参考意义。蒽醌类成分是大黄的重要药效成分,对其研究已较为清楚;而对于大黄中另一类成分——鞣质的研究则相对较少。随着对大黄新功能的深入探讨,如今鞣质作为一种药用有效成分也逐渐为人们所认识,特别是大黄鞣质降低血清尿素氮的发现引发了国内外学者的极大兴趣和普遍关注。笔者以熟大黄为研究对象,同时考察了蒽醌和鞣质类指标成分,通过模拟人体胃肠pH值环境,比较熟大黄在4种不同溶出介质中的溶出差异。由于游离蒽醌在水、人工胃液、人工肠液及磷酸盐缓冲液中溶解度较小,故文章采用溶出绝对量作为考察指标。本研究发现,鞣质类成分(以没食子酸为指标)的溶出量大于蒽醌类成分,鞣质类成分在不同pH介质中溶出速度有一定差异,但溶出量差异不明显。而大黄蒽醌类成分在溶出介质水解前只能检测到大黄酸,该结果与相关文献报道类似;溶出介质水解后5种蒽醌成分均可检测到,提示大黄蒽醌溶出主要以结合型为主;蒽醌成分在酸性的人工胃液中的溶出量最低,在近中性和偏碱性溶液中溶出量相对较高,尤其是在pH8.4的磷酸盐缓冲液中溶出较好,提示大黄蒽醌类成分(主要指结合型蒽醌)在肠道尤其是大肠部位溶出较好,通过制剂学手段延长大黄在肠道停留时间将有助于提高蒽醌成分生物利用度。由于含大黄的口服中成药不同剂型在消化道各段的崩解行为可能不同,必然导致不同剂型间的体内溶出吸收存在较大差异,影响中成药临床应用的准确性和稳定性。中成药口服溶出行为评价对于保障临床用药安全