中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构及形成机制

中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构及形成机制

大多数浅棕色动物的卵（胚胎）依赖于茎或卵石，囊被囊附并完全孵存出雌性腹部的囊毛（堵塞南山，1993；杨万喜等人，1996；dal，1965；cheung，1966；fisherandclark，1983；gooda和lachasi，1983；saigusa等人，2002）。卵子的成功附着对胚胎的正常发育具有重要的生物学意义。因此数十年来十足目甲壳动物卵附着机制一直受到许多学者的重视。但迄今为止,关于胚胎附着系统的结构、卵柄或卵索的形成及胚胎附着机制尚存许多争议(堵南山等,1995;杨万喜等,1996;应雪萍等,2004a;薛俊增、吴惠仙,2004;AikenandWaddy,1982;Cheung,1966;FisherandClark,1983;GoudeauandLachaise,1980,1983;Goudeauetal.,1987;Hinsch,1990;Saigusa,1993;SaigusaandTerajima,2000;Saigusaetal.,2002;Stephens,1952;TalbotandHarper,1984;TalbotandGondeau,1988;Thomas,1991;Yonge,1937,1955)。中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis),隶属于甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),是我国特有的淡水养殖种类。其胚胎发育在雌体腹肢形成的特殊孵化室中进行。在育苗生产中,经常出现胚胎未发育完成就从孵化室脱落的现象,这种现象称为流产(Egg-loss)。有学者认为胚胎附着系统的异常形成与胚胎的流产有直接的相关性(TalbotandZao,1991;TalbotandHarper,1984;杨万喜等,1996)。中华绒螯蟹的胚胎流产机理至今仍悬而未决。堵南山等(1995)曾报道了中华绒螯蟹成熟卵的形态和超微结构;杨万喜、周宏(2000)曾对中华绒螯蟹的腹肢粘液腺进行了初步研究,发现粘液腺与胚胎附着系统的形成有关;应雪萍等(2004a)进一步对不同生理阶段的雌蟹腹肢进行组织学与扫描电镜的研究,证实了杨万喜和周宏(2000)的观点。此外,应雪萍等(2004b,2004c)对不同生理阶段的中华绒螯蟹肝胰腺、不同发育时期胚胎的脂肪酸、氨基酸进行分析研究,认为中华绒螯蟹肝胰腺、不同发育时期胚胎中必需脂肪酸及必需氨基酸的种类及含量与胚胎的发育与流产有一定的关系。为进一步弄清中华绒螯蟹胚胎流产机理,阐明粘液腺与胚胎附着系统间的关系,作者用透射电镜和扫描电镜技术对中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构组成及形成机制等进行了观察。1产卵蟹的收集实验所用的中华绒螯蟹取自温州市乐清清江养殖场。分别于2002年12月至2003年3月、2003年12月至2004年3月先后两次在清江养殖场进行抱卵和孵化实验。并购得温州本地成熟亲蟹10只及已交配的亲蟹100只,带回实验室,置于装有新鲜海水(缓慢升温并恒温至18℃)的5只玻璃缸中(55cm×50cm×40cm),饲喂新鲜的缢蛏(Sinonovaculaconstricta)。本研究的重要步骤是收集那些刚开始产卵的雌蟹,但雌蟹产卵没有可视的信号;在不惊动雌蟹的情况下,在养殖场不能很准确地区分即将产卵蟹与刚开始产卵的蟹。我们的方法是,将部分交配后的雌蟹带回实验室,放在玻璃水族箱中,昼夜连续观察雌蟹的行为变化,这样便于确立即将产卵的蟹,增加了获得即将或者刚刚开始产卵的雌蟹的机率。一旦发现即将或者刚产卵的雌蟹,就跟踪该蟹。本实验共跟踪观察了19只亲蟹的产卵过程,并进行取材。透射电镜用的成熟卵直接从成熟蟹的卵巢中取得,从雌蟹腹部取得刚排出的受精卵、受精卵产出后5min、10min、15min、20min、30min、40min、1h、1.5h、2h、3h、2周后及1个月后的胚胎,这些卵与胚胎用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)配制的2.5%戊二醛(v/v)及1%锇酸(m/m)进行双固定,酒精系列脱水,618环氧树脂渗透并包埋,瑞典LKB2088超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,JEOLJEM-1200EX透射电镜观察并拍照。取成熟蟹卵巢中的卵、刚从生殖孔中排出的受精卵及排出后不同时间的胚胎、抱卵蟹腹肢,用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)配制的2.5%戊二醛及1%饿酸进行双固定,酒精系列脱水,醋酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,离子溅射仪喷金,HitachiS-450及KyKy-1000B扫描电镜观察并拍照。2结果2.1抱卵材料的膜中华绒螯蟹雌蟹具四对腹肢,每一对腹肢分别由内肢(携卵肢)和外肢(非携卵肢)组成,内肢由携卵刚毛(Ovigoroussetae)及其上的携卵绒毛(Ovigoroushair)组成(图版Ⅰ:1,2)。受精卵(胚胎)通过卵柄(Eggstalk)附着在携卵绒毛上(图版Ⅰ:3),部分胚胎通过卵索(Eggfuniculus)彼此相连(图版Ⅰ:4)。透射电镜观察表明:与中华绒螯蟹胚胎附着系统相关的膜有卵膜、卵柄与被膜。卵柄是由成熟胚胎最外层的卵膜延伸而成(图版Ⅰ:5),形成后的卵柄通过包在携卵绒毛外的被膜附着在携卵绒毛上(图版Ⅰ:6,7)。2.1.1电子密度特征图版Ⅰ:8显示了受精卵进入孵化室一个月后的成熟胚胎卵膜的细微结构,卵膜由三层组成:外层的E1、中层E2和内层E3。E1层电子密度较低,又可分为两亚层,称之为E1a和E1b组成(图版Ⅰ:7)。E2层电子密度高,而且较厚(图版Ⅰ:8;图版Ⅱ:9)。最内层E3相对较薄,而且形成时间较长(图版Ⅰ:8)。图版Ⅱ:9显示了E3层正在形成的过程,不同部位厚薄不一。2.1.2卵柄和卵柄的亚层组成图版Ⅰ:5显示卵柄与胚胎交接处的结构。卵柄只有一层组成,且这一层与包裹在胚胎最外层的E1是连续的,此外,卵柄也由两个亚层E1a和E1b组成(图版Ⅱ:10)。卵柄的基部包裹在携卵绒毛上,以产生分层的被膜,被膜的厚度在携卵绒毛的不同侧面而不同,厚的部位约为薄的部位的6倍多(图版Ⅰ:6)。2.1.3携带卵绒的层间和远缘受压ls观察附有卵团的腹肢,发现被膜是由卵柄缠绕在携卵绒毛上形成的。有些缠绕是不完全的,但在大部分情况下,卵柄在刚毛上至少绕了一周(图版Ⅰ:6,7)。被膜的每一部分像卵柄一样,只有E1层(图版Ⅰ:6,7;图版Ⅱ:10)。因此,包裹在携卵绒毛上的被膜、卵柄均来源于卵膜的最外层,属于同源结构。当用镊子拨落成团的胚胎时,大多数绒毛从刚毛上脱离,而被膜仍然紧紧地包在携卵绒毛上。当观察胚胎附着系统的横切面时,可见到E1a直接粘到携卵绒毛上(图版Ⅰ:6,7;图版Ⅱ:10,11)。横切面显示了在携卵绒毛的表面有一层约50nm厚的薄层(α1),此层通过其上以间隔150nm左右的、且有许多纤细的电子密度稍深的、平行排列的嵴与E1a相接触。在α1层的内部有一层电子密度相对较低、约320nm厚的薄层(α2)(图版Ⅱ:11)。2.2产后胚胎配件系统的形成2.2.1--5卵柄及卵期71-20d本文根据在养殖场及实验室中跟踪了19只蟹的产卵行为,结合显微照片给出大概的卵柄形成时间顺序,描述如下。附着准备期:中华绒螯蟹的受精卵从生殖孔产出,然后进入孵化室。在正常情况下,将所有的卵产出大概要15到25min。产卵后,雌蟹静立,腹部半开。与此同时,腹肢的携卵绒毛将卵揉成团。卵刚产出时无粘性。产卵15min后,孵化室内的粘液量增加。这种出现在孵化室内的透明液体称为孵化液,受精卵浸泡在此液体中。此时卵膜已具有粘性,部分卵已开始粘附在携卵绒毛上。从未见到受精卵粘到外肢的羽状刚毛上。卵柄形成期:产卵后20到50min,雌蟹仍静立不动,腹部依旧半开,受精卵继续被携卵绒毛揉成团,但粘到携卵绒毛上的卵的数目显著增加了。当卵粘着到携卵绒毛上时,卵膜开始膨胀。此时,卵膜仍有很强的粘性,被膜开始形成,卵柄初具形态(图版Ⅱ:12)。胚胎附着期:产卵60min后,卵膜的粘性实际上已经降低,浸没卵群的孵化液量减少。产卵后80-140min之间,卵柄形成基本完成,大部分胚胎通过卵柄牢固地附着在携卵绒毛上(图版Ⅱ:13)。随着“卵柄”的形成,雌蟹的腹部开始上下移动,使所有的受精卵都被包在孵化室中。一般产卵2h后,雌蟹腹部停止运动。2.2.2成虫、卵胞外亚层和生殖孔最外层E1的起源和产卵后的形态变化图版Ⅱ:14,15显示了卵巢中成熟卵的结构,卵被卵泡细胞包裹,在其内侧为由两个亚层(称之为E1a′和E1b′)组成的卵黄膜,E1b′的厚度约为E1a′的3倍。卵细胞膜与卵黄膜间为卵周隙,图版Ⅱ:15中可见卵内物质通过细胞膜的突起往此空隙中输送。受精卵从生殖孔排出后,卵细胞膜外仅见由两个亚层组成的膜(E1),E1的两个亚层的厚度均比在卵巢中成熟卵的厚1倍多(图版Ⅱ:16)。受精卵从生殖孔中排出5min(图版Ⅱ:17)到10min(图版Ⅱ:18;图版Ⅲ:19)后,E1与胚胎间的空隙增大,同时胚胎向腔中的分泌活动加强。排卵后20min,E1与胚胎间的分泌物明显增加,并出现大量的膜状结构(图版Ⅲ:20)。随后腔中出现电子密度均匀的颗粒状结构(图版Ⅲ:21),并且范围逐渐扩大,密度也不断增加,里面为一层很薄的E2层(图版Ⅲ:22)。卵排出40-60min后,E1的两个亚层E1a′、E1b′结构发生改变,边界模糊(图版Ⅲ:23),这一状态保持了约20-35min。在产卵后60-90min,E1又分为电子密度明显不同的两个亚层,称之为E1a和E1b(图版Ⅲ:24)。但是这两个新亚层是否与起初的E1a′和E1b′有关,目前尚不清楚。2.2.3卵膜内固定期e除了外层E1,尚有中层E2及内层E3包裹着胚胎。E2层既不在卵柄的结构中,也不在被膜的结构中。E2形成于E1两个亚层在结构上发生变化的时候(图版Ⅲ:23),大概在产卵后40-60min。在E1两个新亚层(E1a和E1b)出现时,E2开始加厚(图版Ⅲ:24)。当卵膜粘附在携卵绒毛上后立即开始膨胀。卵膜粘附在携卵绒毛上的时间大约是产卵后15-50min。此时卵膜具有很强的粘性,胚胎与胚胎的卵膜往往也粘在一起(图版Ⅰ:4)。产卵40min后,E1的两个亚层E1a′、E1b′的结构发生变化,主要表现在两者的电子致密度趋向一致。当E1新的两个亚层出现时,部分区域的E1层与E2层发生分离,这意味着E1开始膨胀或延伸,卵柄开始形成(图版Ⅲ:24)。如图版Ⅲ:25显示E1层附着在携卵绒毛的下半层,卵柄已经形成,并可牢固地附着在携卵绒毛上(图版Ⅱ:13)。E2层形成后,胚胎继续向外分泌物质,为E2层的加厚及E3层的形成做好物质准备(图版Ⅲ:23,24)。E3层的形成可能需要一个很长的过程,图版Ⅲ:26显示的是排卵2周后的胚胎,E3层已初步形成。3讨论3.1膜的形成与亚层的结构中华绒螯蟹胚胎附着系统由卵膜、卵柄及包裹在携卵绒毛上的被膜三部分组成。这与红螯相手蟹(Sesarmahaematocheir)胚胎附着系统的结构相似(Saigusa,1994;Saigusaetal.,2002)。我们还发现刚产入雌蟹孵化室中的受精卵拥有由两个亚层组成的E1层,在排卵后E1的两个亚层电子致密度趋向一致,但随后又重新形成两个亚层。卵柄和包在携卵绒毛外的被膜仅由卵膜的最外层E1组成,这与Saigusaetal.(2002)、Goudeauetal.(1983)分别对红螯相手蟹和滨蟹(Carcinusmaenas)的研究结果一致。但两个亚层发生融合的时间及被膜、卵柄的形成,不同种类有一定的区别。红螯相手蟹在排卵后5-10min,其两个亚层就发生融合,然后被膜和卵柄相继形成;中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构形成相对较慢,这可能与动物个体的大小相关。中华绒螯蟹成熟胚胎的卵膜由E1、E2、E3三层组成,这与其它许多甲壳动物的卵膜结构一致,但E2层、E3层形成的时间不同种类差异较大(Cheung,1966;Goudeauandlachaise,1983;Goudeauetal.,1987)。堵南山等(1995)曾对中华绒螯蟹成熟卵形态的超微结构进行观察,他们认为成熟蟹卵由三层卵膜组成,根据该文图文描述的特点,这三层膜其实就是本文中成熟卵卵膜的E1a′(又可分为电子密度不同的两个小亚层)和E1b′(图Ⅱ:14,15)。Cheung(1966)用光学显微镜观察了滨蟹(Carcinusmaenas)成熟胚胎的卵膜,其所描述的三层结构与我们所报道的中华绒螯蟹的三层卵膜有所差异。GoudeauandLachaise(1980)也对滨蟹的卵膜形成过程进行了透射电镜的研究,其描述的最外层E1和最厚层E2与中华绒螯蟹的E1、E2层较为相似,但没有看到E3层的结构。后来Goudeauetal.(1987)进一步对滨蟹胚胎发育整个过程的卵膜进行研究,发现了卵膜的三层结构。此外,Saigusaetal.(2002)对红螯相手蟹成熟胚胎的胚胎附着系统的结构和形成过程的描述与本研究的结果较相似。这可能是不同动物种类的胚胎,其三层膜的结构、性质及比例均有一定差异;或是由于不同学者所取的胚胎成熟度不一所致。3.2卵膜膨胀、组织、腹或多卵一材料等时放置时的胚胎附着方式中华绒螯蟹产卵后E1a′、E1b′层的膨胀或许在皮层反应时产生,这层的膨胀是首次有价值的形态变化(GoudeauandLachaise,1980;TalbotandGoudeau,1988)。在产卵后40min,E1a′和E1b′的电子致密度趋向一致。产卵后60min,新的亚层E1a和E1b形成。中华绒螯蟹与其它甲壳动物一样,刚产出卵的卵膜也是单一的,之后,随着E1a′和E1b′的电子致密度趋向一致及新E1层的形成,卵膜膨胀并变得有粘性,通过雌蟹腹部不断运动,腹肢揉动胚胎,这种行为将增大卵膜与携卵绒毛间的接触面积,卵膜延伸,并产生卵柄(杨万喜等,1996;GoudeauandLachaise,1980;Goudeauetal.,1987;Cheung,1966;TalbotandGoudeau,1988;Saigusaetal.,2002)。因此,十足类甲壳动物的胚胎附着可能由相同的方式进行。一些十足目甲壳动物,如海喇蛄属(Homarus)(Yonge,1937;TalbotandHarper,1984)、小长臂虾属(Palaemonetes)(Burkenroad,1947)和长臂虾属(Palaemon)(FisherandClark,1983)动物的胚胎,不仅通过卵柄附着在携卵绒毛上,而且部分胚胎也通过卵索相互附着在一起。薛俊增和吴惠仙(2004)在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的胚胎附着中也发现这种现象,并称之为多卵一刚毛式附着。中华绒螯蟹胚胎间也有相互附着的现象,但很少。在中华绒螯蟹的卵膜粘性很强时,将不仅会附着在携卵绒毛上,而且胚胎间也会