微生物快速检测 2节2 食品微生物 免疫标记技术 1

1第二节食品致病菌检测新技术2

第四类

现代快速免疫检测技术浙江工商大学食品与生物工程学院赵广英教授2学时数：第2章第二节共计6学时，分六部分，每一部分1＋1＝2学时。

教学目的：了解和掌握食品致病微生物定性快速检测技术，包括含义、机理、特点、应用情况和发展现状与趋势等。难点：真正系统掌握各类食品致病微生物定性快速检测技术。3第四类

现代快速免疫检测技术4目录序简述基础免疫学检测技术1.免疫浊度法2.分子印迹技术3.免疫传感器与食品安全快速检测4.免疫标记技术与食品安全快速检测

（免疫标记荧光、酶、同位素和生物素、胶体金等物质）5序：简述基础免疫学检测技术抗原和抗体反应凝集试验（多种）沉淀实验（多种）补体结合实验中和实验等（多种）免疫标记技术：荧光标记技术、酶标记技术等以上述技术为基础，介绍由此发展起来的多种免疫学快速检测技术。6抗原和抗体反应反应关系和结合位点：抗原、抗体、抗抗体、SPA蛋白免疫反应种类：直接法、间接法、夹心法、竞争法7免疫反应各成份间的关系明确抗原、抗体、抗抗体之间的关系1TTYTYTYYYTYYY抗原抗体抗抗体12345678免疫标记反应的类型直接法间接法夹心法竞争法Y**YYY*Y*Ag(已知)+（Ab，少量已知＋Ag？）Y*？？Y*？Y*？＝＋已知9抗原、抗体的制备抗原制备：抗原：天然的抗原、半抗原；抗原灭活：使其毒性被灭活，但应尽可能的保持其抗原性。10抗体制备：抗体种类：天然抗体、多价抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、酶切抗体片段、人工合成抗体分子活性部位等。抗体、抗抗体、各种标记抗体葡萄球菌A蛋白单克隆抗体制备凝集试验（agglutinationtest）

环状沉淀试验（ringprecipitationtest）

15双向双扩散试验：也称为琼脂扩散试验

对流免疫电泳（counterimmunoelectrophoresis）171、免疫浊度法20世纪70年代出现了微量免疫沉淀测定法，即免疫透射浊度测定法、免疫散射浊度测定法和免疫胶乳浊度测定法。透射比浊法和散射比浊法1.1、基本原理：利用抗原抗体结合后的复合物形成的颗粒增大，对光的透射和散射性能改变，进行检测。181.2、相关仪器这3种技术皆已常规用于临床体液蛋白的检测，并已创造出了多种自动化仪器。透射比浊分析仪包括：、

分光光度计：近紫外光（400－500nm）有一吸收值

终点比浊仪：国内外都有生产，

近红外自动分析仪

其他自动化分析仪：离心式自动分析仪分立式自动分析仪如多通道分立式自动分析仪：600－3600tests/h，有OLYMPUSAU560600系列

HITACHI7150等.都有配套软硬件

快速免疫比浊分析仪19散射比浊分析仪：离心式自动分析仪氦氖激光比浊仪速率法自动散射比浊仪：流动式任选式散射光浊度仪

WGZ-1WGZ型系列2100P便携式浊度计WGZ-1AWGZ型系列散射光浊度仪/prolist/prokind_404_1.htm202分子印迹技术

什么是分子印迹技术？分子印迹技术是二十世纪八十年代迅速发展起来的一种化学分析技术，通常被人们描述为创造与识别“分子钥匙”的“人工锁”技术。21222324252627分子印迹技术的特点(1)预定性：即它可以根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足各种不同的需要。(2)识别性：即MIPS是按照模板分子定做的，可专一地识别印迹分子。(3)实用性：即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟，但由于它是由化学合成的方法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。28分子印迹技术的应用抗体－抗原识别－－人工抗体293031由于MIPS对于印迹分子的高选择性，故可以作为仿生传感器的分子识别元件;这种分子识别作用可以通过信号转化器(压电晶体、电极、电阻等)输出，分子印迹技术的应用用于化学仿生传感器然后通过各种电、热、光等手段转换成可测信号，可定量分析各种小分子有机化合物3233用于模拟天然“杭体”MIPS与印迹分子之间作用的强度与选择性在一定程度上可以和抗原与抗体之间的作用相媲美，因而可用于抗体模拟,这种模拟抗体制备简单、成本低，在高温、酸碱及有机溶剂中具有较好的稳定性，此外还可以重复使用。34发展趋势(1)分子印迹和识别过程的机理将从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展，从分子水平上认识印迹和识别过程。(2)合成种类更多性能更好的功能单体和交联剂，提高分子印迹聚合物的吸附行为和吸附容量。(3)分子印迹和识别过程将从有机相转向水相。(4)手性分离和固相萃取氨基酸手性药物将步入产业化阶段。(5)印迹技术将从氨基酸药物等小分子超分子过渡到核苷酸、多糖、蛋白质等生物大分子甚至生物活体细胞。(6)MIPs用于辅助合成和仿生传感器将获得较快发展。（7）在医学相关领域，包括食品安全快速检测领域快速发展可以预计随着化学、生物学、材料学和现代分析技术的不断发展，分子印迹技术将会在分离分析和催化等诸多领域发挥越来越大的作用。

合成理想的人工抗体并获得理想的检测应用结果比较难363.电化学免疫传感器

3.1

概念1975年Janata第一次报道免疫电极；1990年Henry等提出了免疫传感器的概念：免疫传感器(Immunosensor)是指在传感界面固定抗原/抗体，通过测量由抗原、抗体特异性结合引起的物理、化学信号的变化来间接测定样品中抗原/抗体（的定性和定量）浓度的传感器。

373.2基本原理

抗原–抗体结合前后可导致多种信号的改变，如重量、光学、热学、电化学等。电化学分析有其独到之处，如可以实现现场检测，不受样品颜色、浊度的影响(即样品可以不经处理，无需分离)，所用仪器设备相对简单等，因此电化学免疫传感器(Electrochemicalimmuno－sensor)应用前景被看好。图1-2电化学免疫传感器的基本原理Fig.1-2Basicprincipleoftheelectrochemicalimmunosensor393.4电化学免疫传感器分类非标记型免疫传感器标记型免疫传感器电容型电位型电导型电流型：最为成熟，应用最广泛40非标记型免疫传感器：原理为不使用任何标记物，根据蛋白质分子（抗原或抗体）携带大量电荷，当抗原抗体结合时会产生电导率、膜电位、离子浓度等若干电化学或电学的变化，根据这种变化可以检测免疫反应的发生。此种传感器响应快速、操作容易，但信号弱，灵敏度较低。标记型免疫传感器：原理为用酶、红细胞、放射性同位素、金属、噬菌体等作为标记物标记抗体/抗原，利用抗原抗体反应的特异性，检测抗原/抗体。标记物通常起到信号放大作用。故灵敏度大大增强。41电流型酶免疫传感器是电流型免疫传感器的重点研究领域。它将酶的化学放大功能与免疫电极的特异性相结合，兼得二者优点，具备免疫反应的特异性和电化学分析的灵敏性，尤其在对低含量物质的检测中发挥着重要作用。

图1-4电流型酶免疫传感器基本原理Fig.1-4Basicprincipleofamperometricenzymeimmunosensor

e为电子，M为电子媒介体，E为酶，S为底物，P为酶促反应产物整个反应过程，酶和电子媒介体都没有损失，只有底物S变为酶促反应产物P

423.5抗体固定化方法抗体固定化方法是研制免疫传感器的关键技术之一，其直接决定着免疫传感器的性能。抗体固定化方法应满足以下条件：固化后的抗体仍能保持良好的生物活性和高度选择性；固定化层需具有良好的稳定性和耐用性，能适应多种测试环境。抗体固定化方法：

吸附法、电聚合法、包埋法和共价键交联法。433.6电化学免疫传感器的研究领域已涉及领域包括：医学环境

食品*畜牧业军事等领域。

443.7ECIS在食品安全检测中的研究

电化学免疫传感器在食品安全检测领域中已有部分研究报道，主要集中于生物毒素检测、致病微生物检测、农残和兽残检测等方面。电化学免疫传感器还少有实际应用，关键技术问题桎梏其应用：电极、生物活性物质的修饰、电化学信号放大等。3.8

本室电化学免疫传感器改进研究

将电化学免疫传感器技术引入到食品致病菌快速检测领域，进行关键技术的改进研究电极改进设计试验电极修饰方法改进多种免疫电极研制反应信号放大研究副溶血性弧菌免疫传感器鸡白痢沙菌免疫传感器弗氏志贺氏菌免疫传感器禽流感抗原/抗体免疫传感器46敏感性检测数据参数的选定电化学检测方法确定修饰条件的优化时间、温度、浓度等电极生物敏感元件的修饰电极选择特异性准确性免疫传感器性能测定稳定性信号采集转换放大显示系统构建基于MWCNT/SA/CMC复合物的E.coliO157:H7酶免疫传感器SEM或AFM表征CV表征底液pH选择底液中H2O2量选择孵育条件选择4-SPCE修饰电极的表征测定条件优化免疫电极性能检验检测线性关系特异性准确性重现性、稳定性直接法MWCNT/SA/CMC修饰的4-SPCE48基于MWCNT/SA修饰的E.coliO157:H7

直接法酶免疫传感器海藻酸钠（SA）是一种天然的生物高聚物，具有良好的生物相容性，无毒，无刺激，因此可作为优良的载体保持蛋白酶活性。multi-wallcarbonnanotubes(MWCNT多壁碳纳米管)/sodiumalginate(SA)免疫电极的制作过程及电极表面的反应原理图

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基于MWCNT/SA修饰的E.coliO157:H7

直接法酶免疫传感器图1不同修饰电极的AFM表征图：(a)MWCNT/SA修饰电极；(b)免疫电极；(c)免疫电极孵育抗原后

不同电极的原子力表征

50不同电极的循环伏安表征基于MWCNT/SA修饰的E.coliO157:H7

直接法酶免疫传感器图2不同电极在测试底液中的循环伏安曲线：(a)裸电极；(b)MWCNT/SA修饰电极；(c)MWCNT/SA/HRP-anti-E.coliO157:H7修饰电极；(d)免疫电极结合抗原后51图7免疫传感器的特异性基于MWCNT/SA修饰的E.coliO157:H7

直接法酶免疫传感器特异性52免疫电极的制作过程及电极表面的反应原理图基于MWCNT/SA修饰的E.coliO157:H7

夹心法酶免疫传感器53图1不同电极在测试底液中的循