中山大学生科院《生物技术学》课件-真核生物系统生物技术应用

真核生物系统生物技术应用－1（一）生物技术与种植业什么是植物生物技术？植物生物技术是在植物细胞和分子水平修饰和改造遗传性状的生物技术，主要包括植物基因工程、植物细胞工程等。是生物技术中除医药生物技术外另一个最受瞩目的学科。全球人口的增长上图中描绘了新石器革命(约公元前l0000年)和工业革命(约于1760年在英格兰开始)之后世界人口的急剧增长及其继续趋势。上世纪后半叶人口爆炸已导致了第三世界人口稠密国家过分拥挤和营养不良。使粮食产量的显著增长不能适应人口的增加．这主要是由于上世纪70年代初期以来很高的人口增长比率。到2005年，世界人口的增长从l983年的47．2亿增加到60亿，而到2025年，全球人口将达到80亿。世界粮食危机目前40个国家需要国际粮食援助。未来粮食产量剧增的前景希望很小，因为大部分可耕地在亚洲季风区己被开发和利用。未开发的有潜力可用的土地仅在巴西和非洲的一些部分被发现。满足全球的粮食需求，只能靠提高作物的单产量来实现。气候变化的挑战气候变化使全球农业粮食产量下降，2004－2006，每年12－15％。世界的谷物库存率在1999年时为31.6%，至2006年已降至15.5%，约50天。气候变暖可能使土豆和花生等农作物的野生亲缘植物灭绝，给帮助这些农作物抵抗害虫和干旱的宝贵基因源带来威胁。未来50年，51种野生花生中有超过60%会灭绝，108种野生土豆中12%会灭绝。为什么要发展植物生物技术？植物生物技术能够突破天然种间屏障进行的杂交,针对某种特性，以突变、植入外源基因或改变基因表现等生物技术方式，进行遗传物质的修饰，进而降低生产成本，加快植物生长速度、增强对环境的抗性等，为培育优良作物新品种带来希望。

（一）植物基因工程一、植物基因工程的基本原理植物基因工程，也称转基因技术（geneticmodification,GM），是在分子水平对植物基因进行操作的技术。它通过基因工程手段，利用特定的载体将外源的基因转移到受体植物中，改造植物的遗传物质，达到改良生物性状或获得有用基因产物的目的。通俗的说，转基因(transgene)就是一种生物体内的基因转移到另一种生物或同种生物的不同品种中的过程。

人们对植物进行遗传转化的最终目的是让外源基因在受体植物基因组中得到稳定整合并在当代及其子代中得到有效、稳定的表达。一般来讲，获得转基因植物主要分为三个步骤：

1、目的基因的获得：以人工方法在现有的生物中分离和克隆所需要的目的基因，或人工合成目的基因。

2、外源基因的转化和整合：外源基因通过载体、媒体或其它物理化学方法导入植物细胞并得到整合和表达的过程。

1）基因从一种生物体内转移到另外一种生物体内需要一定的载体。现有质粒载体、病毒载体、脂质载体、原生质载体等多种方法；其中以质粒载体最为常见。

2）植物基因的遗传转化是指将外源DNA通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞并得到整合和表达的过程。实现这一转化的途径称之为转化系统。外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之为基因载体转化系统。

目前已经建立了十余种基因转化方法，常见的方法包括：

（1）土壤农杆菌介导法：

几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌（A.tumefaciens）感染，而产生根瘤。其致瘤特性由Ti（tumor－inducing）质粒介导;Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb;T-DNA的整合机制表达载体pBIn19的结构农杆菌介导的转化法的优缺点操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化；单双子叶植物受限制；

苏云金杆菌的δ-内毒素苏云金杆菌在孢子形成的过程中，细胞内形成杀虫晶体蛋白—称为δ-内毒素，其活性很强，有时要比有机磷毒性高80000倍，而且选择性很强，不同品系的细菌和成不同的毒蛋白。在细菌中积累的δ-内毒素是无活性的前体，昆虫食用后，前毒素被蛋白酶消化后产生有毒性的蛋白，结合到昆虫肠道内，破坏表皮细胞，使昆虫不能进食，从而饥饿而死。不同昆虫中，晶体结构不同产生了特异性。苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白CryI鳞翅目幼虫CryII鳞翅目和双翅目幼虫CryIII鳞翅目CryIV双翅目CryV线虫纲CryVI线虫纲苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因

(2)基因枪法（biolistics）也称微粒轰击法（microparticlebombardment）

基因枪法最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下：

DNA微弹的制备

DNA-微弹载体的制备

靶外植体准备

DNA微弹轰击

轰击后外植体的培养

基因枪法的优缺点无宿主限制，受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分生组织等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以；可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞；操作简便迅速；缺点：相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大；遗传稳定性差；（3）电激法(electroporation)：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入植物细胞的转化方法。（4）花粉管导入法：即利用花粉管通道，将外源DNA注入进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞(卵、早期胚细胞)，并自然发育成种子。花粉管通道法不仅可以用于外源总DNA的导入，也可以用于基因的导入，有方法简便，基因转化效率高等优点。

3.转基因植物的培育及传代：筛选和培养含有外源基因的细胞或组织，通过细胞或组织培养技术再生成健康的转基因植物，再通过有性繁殖将优良性状传递给下一代。

二、转基因植物的主要种类及地区分布

自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，迄今为止，国际上获得转基因植株的植物已达120种以上。而自1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，2002年9月国际上已有50个国家批准超过2万例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有60多种。1994年首例转基因植物产品（耐储存番茄）在美国获准进入市场，转基因植物产业化取得了突破性进展，各国批准的上市的转基因植物品种已超过100个（次）。1996年转基因农作物开始大规模种植，到2008年已增长80多倍，主要品种包括大豆、玉米、棉花和油菜，主要涉及抗虫和抗除草剂特性，分布于25个国家，但欧洲仅德国、西班牙和保加利亚有少量种植。

全球转基因植物产品的销售额1998年为15－30亿美元，2000年为30亿美元，2002达到50亿美元，2008年达69亿美元，2010年可达到100亿美元。2001年各国种植转基因农作物面积国家主要转基因作物面积万公顷比例％美国大豆、玉米、棉花、油菜35.768阿根廷大豆、玉米、棉花等11.822加拿大大豆、玉米、棉花、油菜3.26中国棉花1.53南非大豆、玉米、棉花等0.2墨西哥大豆、棉花等0.2其它大豆、玉米、棉花等－－2004年各国种植转基因农作物面积(ISAAA)国家主要转基因作物面积（100万公顷）年增％美国大豆、玉米、棉花、油菜47.611阿根廷大豆、玉米、棉花等16.217加拿大大豆、玉米、棉花、油菜5.4023中国棉花3.732南非大豆、玉米、棉花等0.7525西班牙大豆、棉花等0.588018国81.020全球转基因农作物种植面积全球转基因农作物销售额及预测我国转基因抗虫棉花产业化现状分析：我国是棉花生产大国，棉铃虫病持续大爆发，1997年以前年经济损失50－100亿，而棉农大量使用农药，严重污染环境。1997年以来，转基因抗虫棉花逐步推广，棉铃虫病基本得到控制。我国转基因抗虫棉花种植面积我国转基因抗虫棉花效益分析2002年推广种植抗虫棉花252万公顷效益：增产、减少使用农药及劳动力，每亩约140元，经济效益达55亿元。社会效益转基因大豆在中国1995年，我国大豆对外依存度只有7%左右，2005年已经上升到60%~70%。2008年，中国进口大豆达到3744万吨，自产大豆约1650万吨，进口大豆占总供应量的比例达到69%。中国对进口大豆的需求未来几年内预计还将持续增加。转基因大豆在中国“东北地区产非转基因大豆与进口转基因大豆正在展开一场战争”;东北是我国大豆的主产区，但今年以来黑龙江、吉林和辽宁三省的大豆进口量均出现了激增。一季度，上述三个省份分别进口大豆44.1万吨、37.3万吨和28万吨，同比增幅分别达到了84.5倍、2.6倍和1.6倍。进口大豆3000-3500元/吨；国产大豆收购价3400元/吨。三、转基因植物的安全性

转基因植物的安全性评价是指对重组DNA导入植物体内所获得的遗传工程体及其产品对人类健康、人类赖以生存的环境、农业生态平衡等方面可能造成的影响进行安全性预测和评价。对于转基因生物的疑虑主要有两个方面，一是对人体健康是否有害，即食品的安全性；二是对生态环境是否构成潜在威胁，即环境的安全性。

1、基因植物的食品安全性评价

对于转基因植物的食品安全性评价，世界上多数国际采用经济合作发展组织（OrganizationofEconomicCo-operationandDevelopment,OECD）1993年提出的实质等同性（substantialequivalence）原则。转基因植物及其加工食品的安全性（1）转基因作物安全性争议的几大事件：1995加拿大“超级杂草”事件：转基因油菜；1998年苏格兰“马铃薯”事件：转基因马铃薯引起老鼠器官发育异常？1999美国“斑蝶”事件：《自然》论文，斑蝶食用转Bt玉米花粉后，44％死亡，破坏生态？2002中国转Bt棉事件：破坏农田昆虫生态？（1）如果转基因食品与传统食品具的实质等同性，则认为是安全的。

（2）如果转基因食品与传统食品除引入的新性状外具有实质等同性，则需时行严格的安全性状价。

（3）如果转基因食品与传统食品不具有实质等同性，则应从营养性和安全性角度进行全面分析。

在对转基因的食品进行实质等同性评价时，一般应主要考虑以下几个方面：首先是有无毒性，转基因植物必须确保转入的外源基因或基因产物对人畜无毒。其次是有无过敏性。另外还要考虑营养物质、抗营养因子的含量及标记基因的安全性等。

2.转基因植物的环境安全性

对转基因植物的环境安全性评价的核心问题是转基因植物释放到田间去是否会将基因（包括转基因）转移到野生植物中，或是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。

转基因作物的潜在风险（1）转基因作物可能变为杂草；（2）转基因作物使野生近缘种变为杂草；（3）可能产生新的病害；（4）转基因作物对环境生态的长期破坏；（5）对非目标生物的伤害等。选择性标记的安全性大部分植物载体含有kan抗性基因，以便筛选转基因植株。kan抗性基因，又称为nptII，来自于细菌编码新霉素转移酶II，担忧：

1）食品中的kan抗性基因是否能传给人体肠道中的细菌，产生对抗生素的抗性。

2）kan抗性基因能否传给环境中的其他生物，导致生态系统的破坏；转基因食品通过人体的消化道与肠道中的细菌接触之前kan抗性基因已经被破坏，转化到细菌的机会也非常少；然而危险因素并不等于0；去除标记基因利用噬菌体P1含有Cre基因，它识别一个34kb的跨越序列，并可以将中间序列切除；利用这一系统，必须使用两个克隆载体进行转化，其中一个含有目的基因及选择标记基因，选择标记基因两端被Cre靶序列包围；另一个载体含有Cre基因，转化完成后，Cre基因的表达可以将kan抗性基因从植物中切除；利用Cre系统去除标记基因

3．国内外转基因植物的安全性评价概况

欧洲政坛和媒体普遍持怀疑态度；

1999年欧盟7国决定，暂停研发新的转基因食品；欧洲环保分子经常发生毁坏转基因作物试验田事件；美国、加拿大的民众73％的消费者接受转基因食品；美国60％的加工食品中含转基因成分；2000年美、中、印、巴等科学院发表白皮书支持；四、转基因植物的应用

1、植物病毒抗性2、细菌及真菌抗性3、植物的抗逆性4、植物的性状改良5、转基因花卉

抗病毒植物I病毒外壳蛋白基因

Cp基因可能以下述作用方式使植物获得保护：（1）当裸露的病毒遗传物质进入植物细胞后，立即被外壳蛋白包装，阻止病毒核酸的翻译与复制。（2）在Cp水平上阻止病毒脱壳。TMV外壳蛋白CP的转基因烟草植物，该转基因植物在TMV存在条件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。马铃薯、番茄、苜蓿、番木瓜等也已成功；

转TMV外壳蛋白CP的烟草植物抗病毒植物II转表达复制酶亚基反义基因的植物：

将TMV5'端基因片段（含复制酶亚基因）作为目的基因，成功地构建了其反义基因的转烟草植株。实验结果表明，病毒RNA的合成抑制了25~50倍。系统的病毒侵染症状特征消失或大量减少。

此外，卫星RNA、核糖体失活蛋白基因、干扰素也成功的应用于转基因抗病毒植物的培育。延迟果实成熟转基因番茄

多聚半乳糖醛酸酶番茄从开花到收获需要大约8周的时间，第6周开始，果实的颜色和风味开始变化，此时成熟过程的基因开始启动，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果实开始软化。运输过程中，造成伤害，降低了商品品质。利用反义RNA延迟番茄果实的成熟从正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端获得了一个730bp的限制性片断，包含了一半的编码序列，将植物的多腺苷酸化信号连接到片段的头部，CaMV启动子连接到尾部，插入Ti质粒pBIN19中。引入植物后，转录后形成了反义RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。实验的结果通过4个途径分析1

）Southern杂交检测反义基因；2

）

利用只能与反义RNA杂交的单链探针，Northern杂交检测反义基因的转录；3

）检测转基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表达量明显低于对照；4

）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，多聚半乳糖醛酸酶的表达量明显降低；转基因果实虽然也在逐渐的成熟，但可以存放很长的时间。这意味着反义RNA虽然不能完全将多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表达量，延缓成熟过程。多聚半乳糖醛酸酶的活性检测抗虫基因作用机制转基因作物的举例Bt（苏云金芽孢杆菌，Bacillusthuringiensis）毒蛋白基因Bt毒蛋白基因合成一种对昆虫有毒的内毒素蛋白。这种杀虫蛋白可以使害虫消化道产生穿孔，从而导致其死亡，而对人畜在内的高等动物无任何毒副作用。玉米、棉花、马铃薯等蛋白酶抑制剂（proteinaseinhibitor,PI）基因用含PI的植物材料或饲料饲喂昆虫后，PI与消化酶（主要为蛋白酶）结合抑制消化酶功能而PI本身则不被降解，严重干扰了昆虫的消化系统，使其生长发育受到严重抑制，最后导致死亡。大豆、玉米、棉花油菜、、马铃薯、番茄等外源凝集素（lectin）基因外源凝集素会在昆虫的消化道内释放出来，并与肠道围食膜上的糖蛋白相结合，影响营养物质的正常吸收。同时，还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道内细菌的增殖，对害虫本身造成为害，达到杀虫的目的。油菜、西红柿、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、烟草、马铃薯、大豆、葡萄等胆固醇氧化酶基因（cholesteroloxidase,Cho）Cho也被称为第二代抗虫基因，其表达的产物是一类新型杀虫剂。胆固醇氧化酶属于乙酰胆固醇氧化酶家族的成员，可催化胆固醇形成17-酮类固醇和过氧化氢。胆固醇是细胞膜的主要组分，伴随着上述反应，昆虫摄食后其肠道表皮细胞出现胞溶现象，导致昆虫死亡。棉花、烟草等抗除草剂基因

抗EPSPS(5-enolpyrvylshikimicacid-3-phosphatesynthase)抑制剂基因

草甘磷类除草剂可破坏植物体内的莽草酸代谢关键酶EPSPS导致植物死亡。抗EPSPS抑制剂基因所产生的酶分子由于点突变，对草甘磷类除草剂不敏感。大豆、玉米、棉花、油菜等膦丝菌素（phosphinothricin,PPT）乙酰转移酶基因PPT除草剂是谷氨酰胺合成酶的抑制剂，可导致植物细胞内氨的大量积累而死亡。PPT乙酰转移酶（PAT）可催化PPT的游离氨基乙酰化而解毒，大豆、油菜、甜菜、马铃薯、番茄等腈水解酶（nitrilase）基因溴苯腈（bromoxynil）是一种抑制植物光合作用的除草剂。腈水解酶可使溴苯腈失去活性，使转基因植物对PPT产生抗性。棉花、油菜、烟草等RoundupReady®

转抗除草剂基因的

大豆和玉米苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因抗病基因＋抗虫基因＋优质基因转BT基因水稻抗稻纵卷叶螟植物生物反应器利用转基因植物作为生物反应器，生产异源蛋白质及其它