RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介

RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介RNAi慢病毒稳转细胞和原核表达简介RNAi慢病毒稳转细胞和第一部分服务干扰现象是1990年由约根森（）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的研究中发现的1998年，安德鲁·法厄（Z.）等在秀丽隐杆线虫（）中进行反义抑制实验时发现，作为对照加入的双链相比正义或反义显示出了更强的抑制效果2第一部分服务干扰现象是1990年由约根森（）1998年，安干扰机理长链3干扰机理长链3三种干扰技术手段4三种干扰技术手段4的应用高通量的研究基因功能基因敲除基因治疗基因表达调控5的应用高通量的研究基因功能51.1合成服务化学合成的具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行有效片段的筛选。61.1合成服务化学合成的具有操作简便、转染效率高、对细胞的偌百优势均由纯化，100％除去尚未配对的单链多种修饰选择：末端修饰（，等），碱基修饰（2’）

化学合成优势操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行有效片段的筛选。7偌百优势化学合成优势7服务流程客户提供：的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计），以及技术要求（包括和的精确数量、纯化类型、修饰要求等）根据序列信息，进行化学合成；纯化；经过分光光度计精确定量冻干处理我们提供：长度19-23碱基/链的，产品形式为退火的双链的冻干粉，有以下选择普通化学修饰－利用2’或2’－修饰以提高在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通；荧光标记对照，包括普通阴性对照（及目的靶细胞中所有基因无同源性的阴性对照）、荧光标记的阴性对照（方便在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件）和阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在实验方法中您的转染、提取物和检测方法是可靠的；常用的阳性对照有，，P53，等）8服务流程客户提供：的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计）1.2载体构建服务使用载体的优势实现瞬时或稳定的靶标抑制在任何类型的细胞（甚至是难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞）中执行通过诱导型表达来调控基因抑制选择稳定表达序列的纯细胞群通过组织特异性启动子控制体内基因表达91.2载体构建服务使用载体的优势9三种载体构建方式干扰载体构建：（）干扰载体构建干扰载体构建

10三种载体构建方式干扰载体构建：10

利用产生效果11

利用产生效果11诺百优势质量保证：针对一个基因的不同位置设计4条序列，在转染效率>80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的。多种平台载体可供选择：载体，干扰载体（第二代干扰载体），载体（第三代干扰载体）利用绿色荧光蛋白（）和感兴趣的序列协同表达，方便追踪可将多个序列串联到同一表达载体中并同时表达，进行多个靶基因的同时干扰12诺百优势质量保证：针对一个基因的不同位置设计4条序列，在转染服务流程客户提供：基因的针对特定基因，设计序列；合成该序列并退火生成双链将及载体相连，连接物转化大肠杆菌测定全长序列以鉴定序列的正确性；制备甘油菌提供数据分析和报告给客户我们提供：构建好的表达载体和相应的甘油菌13服务流程客户提供：基因的131.3干扰服务在研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适化，可以获得高敲除效果。因此，为了将研究成功导入，需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。我们采用实时荧光定量或免疫蛋白印迹法分析这些干扰序列对靶基因蛋白表达水平的抑制的有效性141.3干扰服务在研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适诺百优势质量保证：针对某靶基因设计的3条可保证其中两条的效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）；针对某靶基因的4条序列，在转染效率>80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的。可针对客户选择的靶细胞系，进行转染条件的优化服务，以确定所选择的细胞系的有效转染条件。15诺百优势15服务流程客户提供选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤；选择的靶基因的序列号；抗体（如果需要检测）对需要用于转染的细胞进行细胞培养对需要用于转染的细胞进行细胞培养；优化转染条件：在荧光显微镜下检测或可表达的干扰载体的荧光强度，评估转染效率为靶基因设计一组双链或干扰载体采用荧光定量或免疫蛋白印迹评估转染后某一时间点靶基因水平或蛋白水平的变化可利用抗生素来筛选稳定表达或的细胞株我们提供：转染效率分析；分析，包括实时荧光定量检测、图片等16服务流程客户提供16第二部分慢病毒的制备和慢病毒干扰服务17第二部分慢病毒的制备和慢病毒干扰服务17|&|4/19/2011?非分裂细胞原代细胞干细胞生长抑制细胞模式动物快速分裂细胞易转染细胞类型–293，CHO，etc,质粒转染病毒导入难转染细胞动物实验18|&|4/19/2011?非分裂细&病毒表达系统

分裂细胞非分裂细胞分裂细胞神经细胞药物处理或生长抑制细胞接触抑制细胞腺病毒**慢病毒******逆转录病毒**瞬时表达——腺病毒稳定表达——慢病毒19&病毒表达系统分裂细胞非分裂细胞分裂细胞神经细胞慢病毒表达系统源于1983年法国科学家发现；2008年获诺贝尔生理医学奖|&|12/6/2019弗朗索瓦丝·巴尔－西诺西吕克·蒙塔尼20慢病毒表达系统源于1983年法国科学家发现；2008年获诺

|&|12/6/2019，200921|&|12/6/2019，2

|&|12/6/201922|&|12/6/20192I–|&|12/6/2019

2008.2:151-159.2008.3:340-345.2008.3:346-353.

2006.24;615-623.

2002.420(6911):74-78.B2003.J198(4):581-589.

2004.USA101(26):9654-9659.2005.25(21):9383-9391.

2003.J278(40):39068-39075.7()2003.J278(21):19396-19405.

2001..86(1):13-16.23I–|&|12/6/2019–，,,,,,,,.

|&|12/6/201924–，,,,,,,,.|(2001..12:2028-2029.):,,,, (2008.8:461–473;200613:484–493;2006.17:1–9.),,(2006..110:37-46),(2004.10:768-779)(2009.27:3443-3449;2008.3:e3973)|&|12/6/2019–25(2001..12:2028-2029.)|-|&|12/6/2019.2009..

26-|&|12/6/2019.&

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30&1622:30&3:. ,().,().

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4: .a.32&4:32慢病毒侵染细胞实例一慢病毒侵染原代细胞-子宫平滑肌瘤细胞的荧光和明视野照片对照

33慢病毒侵染细胞实例一慢病毒侵染原代细胞-子宫平滑肌瘤细胞的荧慢病毒侵染细胞实例二慢病毒侵染一种干细胞(荧光和明视野照片对照)

34慢病毒侵染细胞实例二慢病毒侵染一种干细胞(荧光和明视野照片对慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照)|&|12/6/2019慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照)

慢病毒侵染细胞实例三35慢病毒侵染人脐静脉原代细胞(荧光和明视野照片对照)|慢病毒滴度测定10-210-310-410-510-536慢病毒滴度测定10-210-310-410-510-5363737诺百优势质量保证：如无特殊要求我们将提供至少1含107-108病毒颗粒的病毒液。

去除了病毒的关键蛋白，对人体安全；属于复制缺陷型病毒，不会产生下一代病毒颗粒；已被改造为自身失活性，病毒转导并整合到细胞后不再具有产生具有包装能力的病毒基因组。可根据需要选择组织特异性或细胞特异性启动子38诺百优势38客户提供：含有目标基因的质粒（提供测序图谱）或所要表达的目的基因的名称，序列；所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化；若需要检测外源基因的表达，如需要请提供相应的抗体我们提供：提供重组后的慢病毒载体质粒，并附上对目的基因的鉴定结果；提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液39客户提供：含有目标基因的质粒（提供测序图谱）或所要表达的目的第三部分哺乳动物稳定转染细胞系构建服务稳定转染40第三部分哺乳动物稳定转染细胞系构建服务稳定转染40最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（）和新霉素（）稳转优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。41最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（）和新霉素（）41诺百优势质量保证：可对转染细胞的外源基因表达进行严格鉴定，包括水平和蛋白水平（,免疫蛋白印迹）筛选后可以得到稳定表达外源基因的细胞克隆：质粒整合到染色体上；可使用慢病毒载体转导的实验条件，整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中，可以克服使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。不同选择：使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株42诺百优势42服务流程客户提供：构建好的外源基因载体；待转染的细胞系（1x106个细胞，可传代，倍增时间小于48小时）；关于细胞培养条件的说明。筛选浓度测定：以10-14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。仅作为配图细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到6080%覆盖。细胞转染；抗生素筛选；鉴定筛选结果我们提供：构建好的稳定细胞系及相关的外源基因表达分析43服务流程43第四部分原核表达服务原核表达具有操作方便、快捷