高三生物二轮复习专题五DNA的粗提取与鉴定

专题5课题1《DNA的粗提取与鉴定》DNA的粗提取与鉴定DNA从哪提取？怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？怎样鉴定我们提取的DNA？原理选材步骤鉴定基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性

质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。提取原理2、DNA的溶解性DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线蛋白质在NaCl溶液中的溶解度曲线析出溶解溶解析出0.14mol/L

NaCl溶液2mol/L

NaCl溶液提取思路：选择适当的盐浓度使DNA充分溶解，而杂质沉淀，

或者相反，以初步分离的目的。1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。DNA不溶于酒精，但细胞质中某些蛋白质溶于酒精。DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。——将DNA与蛋白质进一步分离①蛋白酶——水解蛋白质，②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃③洗涤剂——瓦解细胞膜——对DNA无影响——而DNA在80℃以上才会变性——但对DNA没有影响提取原理提取原理二、DNA的鉴定试剂：条件：现象：二苯胺沸水浴沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色鉴定原理实验设计实验材料的选取破碎细胞，获取含DNA的滤液除去滤液中的杂质(纯化)DNA的析出与鉴定实验设计【1】实验材料的选取鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。你会选哪种材料进行实验？思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？常用材料：新鲜的鸡血不能，哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得鸡血细胞极易吸水胀破实验设计【2】破碎细胞，获取含DNA的滤液(1)制备鸡血细胞液取0.1g/ml的柠檬酸钠溶液100ml置于500ml烧杯中，加鸡血180ml，用玻璃棒缓慢搅拌，离心2~3min，除去上清液。防止血液凝固(2)破碎细胞，获取含DNA的溶液向鸡血中加入20ml蒸馏水，单向快速搅拌，最后用1~2层纱布过滤。使细胞吸水涨破，释放胞内物质核液第一次过滤，得到杂质较多的DNA溶液。若是植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜。提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作有利于DNA的溶解1、为什么植物细胞要用洗涤剂溶解细胞膜？2、为什么加入蒸馏水可以使鸡血细胞破裂？因为植物细胞有细胞壁，吸水不会胀破。因为细胞内液的浓度大于外界溶液的浓度即细胞内渗透压高于外界渗透压，细胞一直吸水。实验设计【3】除去滤液中的杂质(纯化)利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，可以通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。【方案一】DNA再溶解第二次过滤，除去蛋白质沉淀第三次过滤，除去蛋白质滤液实验设计【3】除去滤液中的杂质(纯化)直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10~15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。【方案二】将滤液放在60~75℃的恒温水浴箱中保温10~15min，注意严格控制温度范围。【方案三】思考题：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，

与DNA分离实验设计【4】DNA的析出与鉴定与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。(1)DNA的析出动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失。实验设计【4】DNA的析出与鉴定鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。(2)DNA的鉴定现配现用实验设计本实验中有三次过滤,获得什么？过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液

过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液获得含核物质的滤液获取纱布上的DNA粘稠物得到含DNA的滤液实验设计实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物第五次搅拌体积分数为95%的酒精加速了鸡血细胞的破裂，从而释放出DNA目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA实验设计本实验两次析出DNA：第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液析出DNA。第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物除去溶液中的杂质实验操作1、加蒸馏水破碎细胞，得到含有较多杂质的DNA滤液2、加2mol/LNaCl溶液，去除蛋白质沉淀，得到较纯的DNA滤液3、加蒸馏水，NaCl溶液浓度变为0.14mol/L，得到DNA粘稠物5、加95%酒精，得到白色丝状物——DNA4、加2mol/LNaCl溶液，溶解DNA粘稠物原理：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液的溶解度不同，DNA在0.14mol/LNaCl溶液时的溶解度最低。DNA不溶于酒精，但细胞质中某些蛋白质溶于酒精。专题5课题2《多聚酶链式反应扩增DNA片断》基础知识C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脱氧核苷酸一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端游离的-OH端为3′端游离的磷酸基团的末端为5′端（1）DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。4.DNA双螺旋结构特点：（2）

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（A）一定与

配对，鸟嘌呤（G）一定同

配对。两条反向平行双螺旋脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（二）DNA的复制：1.概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。2.时期：有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。3.场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体4.基本条件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸（dNMP）模板:DNA的两条链5.复制特点：a.边解旋边复制b.半保留复制6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行8.复制的意义:DNA分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。参与的组分在体内复制的作用p58PCR技术p62解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链（氢键）提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链(磷酸二酯键)使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸变性TaqDNA聚合酶（耐高温）20～30个核苷酸构成DNA或RNA含有Mg2+的缓冲液一、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/pcr过程细胞内DNA复制PCR相同点①提供DNA模板②四种脱氧核苷酸作原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较1、PCR利用了DNA的

原理。2、DNA的合成方向总是从子链的

端向

端延伸。3、PCR一般经历三十多次循环，每次循环的基本步骤可以分为

三步。4、DNA呈

增长。热变性5′变性、复性、延伸3′指数细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶酶解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高温子链合成一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接(滞后链)两条子链均连续合成复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。二、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步骤：三、实验结果测定实验中DNA含量1、原理通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2、过程①稀释2µL

PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定并计算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算专题5课题3《血红蛋白的提取和分离》思考1、分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。p543、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构4、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。一、基础知识：㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快凝胶颗粒相对分子量小—容易进入通道—路程长—移动慢---后洗脱出来相对分子量大—无法进入通道—路程短—移动快---先洗脱出来凝胶色谱法分离蛋白质的原理由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等㈡缓冲溶液－－洗脱剂

（1）作用：

（2）配制：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？

目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。

2、原理：电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。带电性质的差异大小形状迁移速度㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。3、分类：琼脂糖凝胶电泳和(SDS-)聚丙稀酰胺凝胶电泳。（四）血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由___________